Didelė mokslininko darbo dalis - kurti ir atlikti eksperimentus.

Laboratorinių metodų derinys padės atsakyti į daugumą mokslininkų siūlomų klausimų, o darbo eiga, leidžianti pasiūlyti naujus metodus, priklauso nuo mokslininko išsilavinimo ir patirties.

Biologams ląstelių atvaizdai gali daug pasakyti apie tai, kas vyksta su jų tiriamais procesais ir mechanizmais.

Šviesos mikroskopija yra labai paplitęs biologijos mokslų metodas.

Naudodami dažus, antikūnus ir fluorescencinius zondus, mokslininkai mikroskopo ląstelėse mato vaizdus to, kas kitu atveju būtų per maža, kad būtų galima pamatyti ir net suvokti.

Fluorescenciniai mikroskopai ir fluorochromų naudojimas tapo įmanoma 1930 m.1, o šiandien galima naudoti daugybę fluorochromų derinių baltymams, organelėms ir ląstelių bei audinių struktūroms dažyti.

Fluorochromai (arba fluoroforai) tai molekulės, kurios, sužadintos tam tikro bangos ilgio šviesa, skleidžia tam tikro bangos ilgio šviesą, kurią užfiksuoja mikroskopo lęšiai ir paverčia tikru vaizdu.

Fluorescencijos, lęšių ir kamerų derinys leidžia mums užfiksuoti ląstelėse vykstančių procesų vaizdus įvairiais aspektais.

Pavyzdžiui, naudodami mikroskopą 2,5x arba 4x objektyvu galime matyti platesnį pelės smegenų gabalėlio vaizdą, o 63x objektyvu - smulkias tiriamo aktino citoskeleto detales tame pačiame mėginyje.

Šiems tyrimams atlikti galime naudoti antikūnus arba dažus, nukreiptus prieš konkrečius ląstelėje ar audinyje esančius baltymus, o antikūnas paprastai turi fluoroforą.

Štokso poslinkis paaiškina šį reiškinį: fluoroforai praranda vibracinę energiją spinduliuojamos šviesos pavidalu, kai iš sužadintos būsenos pereina atgal į pagrindinę būseną. Fluorescencijos mikroskopai suteikia šviesos fluoroforui sužadinti ir priima jo išspinduliuotą šviesą. Spinduliuojamą šviesą galima užfiksuoti objektyvu, apdoroti CCD kamera ir paversti skaitmeniniu vaizdu.

Tačiau apie ląstelių vaizdo gavimą pakalbėsime vėliau. Dabar turėtume jus supažindinti su pavyzdžiais ir patarimais, kaip atlikti pagrindinius veiksmus prieš įgyjant vaizdą.

Kaip parinkti ir derinti įvairių tipų dažus ir antikūnus, kad pamatytume ir suprastume ląstelių ar audinių organoidų ir baltymų ryšius?

Pirmiausia mokslininkai turi nustatyti, kokius antikūnus ir dažus naudoti, remdamiesi savo tyrimais.

Pavyzdžiui, šiame straipsnyjeMendonça bandė įvertinti katijoninių kietųjų lipidų nanodalelių (cSLN) poveikį ir galimą riziką žiurkėms. Kasmet kuriama ir tiriama daugybė nanodalelių, kuriomis siekiama pagerinti vaistų ar genų perdavimą daugeliui ligų gydyti. Vienas iš įdomių šio tyrimo klausimų buvo, ar nanodalelės gali pasiekti smegenis, įveikdamos kraujo-smegenų barjerą. Šis barjeras apsaugo mūsų smegenis nuo cirkuliuojančių toksinų ar patogenų, todėl paprastai nepageidautina, kad molekulės kirstų šį barjerą. Tačiau šiuo konkrečiu atveju, Mendonça's buvo siekiama, kad nanodalelės įveiktų barjerą ir pasiektų smegenis, kad ateityje jomis būtų galima tiekti vaistus ar genus.

Norėdami patikrinti, ar nanodalelių yra smegenų parenchimoje, autoriai naudojo endotelio ląstelių kraujagyslių žymeklį RECA-1 (pavaizduotas raudona spalva), o ląstelių branduoliai buvo dažomi mėlynu dažikliu DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolas). Už kraujagyslių ribų taip pat galima pastebėti mažus žalius taškelius, žyminčius nanodaleles, o tai reiškia, kad jos pasiekė smegenų parenchimą.

Peržiūrėkite toliau pateiktą infografiką su atvaizdu.

Mind the Graph infografikas, kaip sukurti imunofluorescencinę grupę

Supraskime, ką daro RECA-1 antikūnas (raudonas).

Šie antikūnai sukurti kaip specifiniai zondai, nukreipti į konkretų antigeną (mūsų atveju - į baltymą RECA-1).

Juos galima žymėti fluoroforu arba vėliau atpažinti antriniu antikūnu, sujungtu su fluoroforu.

Todėl, sužadinus mėginį šviesos šaltiniu, konkretus baltymas, kurio ieškote, bus atpažintas jūsų mėginyje pagal tam tikro bangos ilgio šviesos spinduliavimą..

DAPI atveju šis dažiklis yra branduolių ir nukleosomų kontrbarometras, kuris, prisijungęs prie DNR AT sričių, skleidžia mėlyną fluorescenciją.

Kaip sukurti imunofluorescencinę grupę?

Pradėkite nuo šių žingsnių:

  1. Nusipirkite (arba pasiskolinkite! Mokslas turėtų būti labai naudingas!) tyrimams reikalingų antikūnų ir dažiklių. Pirmenybę teikite pirminiams antikūnams (be zondų), o antrinius antikūnus, būdingus šeimininko rūšiai, pirkite iš pirminių antikūnų. Pavyzdžiui, jei naudojate pirminį antikūną, pagamintą triušiams, naudokite antrinį antikūną prieš triušį. Tai užtikrins specifiškumą. 
  2. Naudojant antrinius antikūnus, žymėtus fluoroforais, signalas sustiprės, nes bus aptikta daugiau antigenų vienam pirminiam antikūnui. Be to, tai yra dinamiškesnis būdas įvairiems tyrimams parengti, nes tyrėjas gali keisti grupės spalvas pagal savo poreikius. 
  3. Kitas svarbus žingsnis - patikrinti, kokius filtrus galima naudoti mikroskope. Turėtumėte įsitikinti, kad jūsų fluoroforų sužadinimo ir išmetimo bangos ilgiai yra sužadinimo ir išmetimo filtruose; priešingu atveju negalėsite užfiksuoti savo zondų išmetimo šviesos. Galite naudoti Fluorescencijos spektrų peržiūra patikrinti suderinamumą.
  4. Įsitikinkite, kad visų jūsų fluoroforų ir dažiklių sužadinimo ir išmetimo bangos ilgiai nesutampa toje pačioje analizėje, Fluorescencijos spektrų peržiūra yra puikus pasirinkimas. Jie apima beveik visus turimus fluoroforus!

Galiausiai patikrinkite hipotetinio eksperimento pavyzdį, kuriame nukleino rūgštims žymėti naudojamas Hoechst 33258, o pirminis antikūnas prieš RECA-1 žymimas antriniu antikūnu Alexa Fluor 647.

Geriausia būtų naudoti mikroskopą su DAPI kubeliu (sužadinimas 377/50, emisija 447/60) ir CY5 kubeliu (sužadinimas 628/40, emisija 685/40). Visą šią informaciją įterpėme į Fluorescencijos spektrų peržiūra ir gavome abiejų dažiklių spektrus bei abiejų kubų dažnių juostos pločius (žiūrėkite spektrą infografike aukščiau).

Šis hipotetinis rašinys yra geras pavyzdys, kai fluoroforų spektrai patenka į sužadinimo ir išmetimo filtrus, todėl tyrėjas gali kuo geriau užfiksuoti savo mėginius.

Dabar metas eiti į laboratoriją ir viską išbandyti praktiškai!

Tikiuosi, kad šie patarimai padės jums atliekant kitą laboratorinį eksperimentą. Sėkmės!

Nuorodos:

  1. Fluorescencinės mikroskopijos įvadas. Nikon's MicroscopyU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy. Žiūrėta 2021-04-11 17:20:40.
Susiję straipsniai
logotipas-užsisakyti

Prenumeruokite mūsų naujienlaiškį

Išskirtinis aukštos kokybės turinys apie veiksmingą vaizdinį
bendravimas mokslo srityje.

- Išskirtinis vadovas
- Dizaino patarimai
- Mokslo naujienos ir tendencijos
- Mokomosios medžiagos ir šablonai