Mikroskopia: Jak naukowcy wykorzystują fluorescencję, aby zajrzeć do wnętrza komórek -

Dużą częścią rutyny naukowca jest projektowanie i przeprowadzanie eksperymentów.

Połączenie technik laboratoryjnych odpowie na większość pytań zaproponowanych przez naukowców, a przepływ pracy w celu zaproponowania nowych metod zależy od doświadczenia i doświadczenia naukowca.

Dla biologów obrazy komórek mogą wiele powiedzieć o tym, co dzieje się z procesami i mechanizmami, które badają.

Mikroskopia świetlna jest bardzo rozpowszechnioną techniką w naukach biologicznych.

Zastosowanie barwników, przeciwciał i sond fluorescencyjnych pozwala naukowcom zobaczyć w komórkach mikroskopowych obrazy tego, co w przeciwnym razie byłoby zbyt małe, aby je zobaczyć, a nawet zrozumieć.

Mikroskopy fluorescencyjne i wykorzystanie fluorochromów stało się możliwe w 1930 roku¹Obecnie możliwych jest wiele kombinacji fluorochromów do barwienia białek, organelli i struktur w komórkach i tkankach.

Fluorochromy (lub fluorofory) to cząsteczki, które po wzbudzeniu światłem o określonej długości fali emitują światło o określonej długości fali, które zostanie przechwycone przez soczewki mikroskopu i przekształcone w rzeczywisty obraz.

Połączenie fluorescencji, obiektywów i kamer pozwala nam uzyskać obraz procesów zachodzących wewnątrz komórek w wielu różnych widokach i aspektach.

Na przykład, korzystając z mikroskopu, mamy szerszy widok wycinka mózgu myszy w obiektywie 2,5x lub 4x, a także drobne szczegóły badanego cytoszkieletu aktyny w tej samej próbce przy użyciu obiektywu 63x.

Aby umożliwić te testy, możemy użyć przeciwciał lub barwników przeciwko określonym białkom obecnym w komórce lub tkance, a przeciwciało zwykle zawiera fluorofor.

Przesunięcie Stokesa wyjaśnia to zjawisko: fluorofory tracą energię wibracyjną w postaci emitowanego światła, gdy przechodzą ze stanu wzbudzonego z powrotem do stanu podstawowego. Mikroskopy fluorescencyjne dostarczają światło do wzbudzenia fluoroforu i odbierają emitowane przez niego światło. Emitowane światło może być rejestrowane przez obiektyw, przetwarzane w kamerze CCD i przekształcane w obraz cyfrowy.

Ale o pozyskiwaniu obrazów komórek porozmawiamy później. Teraz powinniśmy przedstawić przykłady i wskazówki dotyczące głównych kroków przed pozyskaniem obrazu.

Jak wybieramy i łączymy różne rodzaje barwników i przeciwciał, aby zobaczyć i zrozumieć relacje między organellami i białkami wewnątrz komórek lub tkanek?

Po pierwsze, naukowcy muszą określić, które przeciwciała i barwniki należy zastosować w oparciu o ich badania.

Na przykład, w tym artykuleMendonça próbował ocenić skutki i potencjalne zagrożenia związane z kationowymi stałymi nanocząstkami lipidowymi (cSLN) u szczurów. Każdego roku opracowywanych i badanych jest wiele nanocząstek, których celem jest zwiększenie dostarczania leków lub genów w leczeniu wielu chorób. Jednym z interesujących pytań w tym badaniu było to, czy nanocząsteczki były w stanie dotrzeć do mózgu, przekraczając barierę krew-mózg. Bariera ta chroni nasz mózg przed krążącymi toksynami lub patogenami i zwykle nie jest pożądane, aby cząsteczki przekraczały tę barierę. Ale w tym konkretnym przypadku, Mendonça's Celem było, aby nanocząsteczki przekroczyły barierę i dotarły do mózgu, aby dostarczyć leki lub geny w przyszłym zastosowaniu.

Chcąc sprawdzić, czy nanocząsteczki były obecne w miąższu mózgu, autorzy użyli markera komórek śródbłonka dla naczyń o nazwie RECA-1 (reprezentowanego na czerwono), podczas gdy jądra komórkowe zostały zabarwione barwnikiem o nazwie DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindol), który jest niebieski. Możemy również zaobserwować małe zielone kropki dla nanocząstek poza naczyniami, co oznacza, że dotarły one do miąższu mózgu.

Sprawdź poniższą infografikę z obrazem reprezentacyjnym.

Infografika Mind the Graph jak zaprojektować panel do immunofluorescencji

Zrozummy, co robi przeciwciało dla RECA-1 (czerwone).

Przeciwciała te są zaprojektowane jako specyficzne sondy i celują w określony antygen (w naszym przypadku białko RECA-1).

Mogą być one znakowane fluoroforem lub rozpoznawane później przez przeciwciało drugorzędowe połączone z fluoroforem.

Dlatego po wzbudzeniu próbki źródłem światła, konkretne białko, którego szukasz, zostanie rozpoznane w próbce przez emisję światła o określonej długości fali..

W przypadku DAPI barwnik ten jest kontrbarwnikiem jąder i nukleosomów i emituje niebieską fluorescencję po związaniu z regionami AT DNA.

Jak zaprojektować panel do immunofluorescencji?

Zacznij od tych kroków:

Kup (lub pożycz! Nauka powinna bardzo współpracować!) przeciwciała i barwniki niezbędne do badań. Preferuj przeciwciała pierwotne (bez sond) i kupuj przeciwciała wtórne specyficzne dla gatunku gospodarza z przeciwciała pierwotnego. Na przykład, jeśli używasz przeciwciała pierwotnego wyprodukowanego u królików, użyj przeciwciała wtórnego dla anty-królika. Zagwarantuje to specyficzność.
Użycie przeciwciał drugorzędowych znakowanych fluoroforami wzmocni sygnał, wykrywając więcej antygenów na przeciwciało pierwszorzędowe. Jest to również bardziej dynamiczny sposób opracowywania różnych testów, ponieważ pozwala badaczowi modyfikować kolory w panelu w zależności od jego potrzeb.
Kolejnym ważnym krokiem jest sprawdzenie w mikroskopie, jakie filtry są dostępne do użycia. Należy upewnić się, że długości fal wzbudzenia i emisji fluoroforu znajdują się wewnątrz filtrów wzbudzenia i emisji; w przeciwnym razie nie będzie można uchwycić światła emisji z sond. Można użyć Przeglądarka widm fluorescencji aby sprawdzić kompatybilność.
Aby upewnić się, że długości fal wzbudzenia i emisji wszystkich fluoroforów i barwników nie nakładają się w tym samym teście, Przeglądarka widm fluorescencji to świetny wybór. Obejmują one prawie wszystkie dostępne fluorofory!

Na koniec sprawdź przykład hipotetycznego eksperymentu, w którym mamy Hoechst 33258 dla kwasów nukleinowych i pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko RECA-1 znakowane drugorzędowym przeciwciałem Alexa Fluor 647.

Idealnie byłoby użyć mikroskopu dostępnego z kostką DAPI (wzbudzenie 377/50 i emisja 447/60) oraz kostką CY5 (wzbudzenie 628/40 i emisja 685/40). Wszystkie te informacje umieściliśmy na stronie Przeglądarka widm fluorescencji i uzyskał widma dla obu barwników oraz szerokości pasma dla obu kostek (sprawdź widmo na infografice powyżej).

Ten hipotetyczny esej jest dobrym przykładem, w którym widma fluoroforów należą do filtrów wzbudzenia i emisji, umożliwiając badaczowi uchwycenie próbek w najlepszy możliwy sposób.

Teraz nadszedł czas, aby udać się do laboratorium i zastosować wszystko w praktyce!

Mam nadzieję, że te wskazówki pomogą ci w następnym eksperymencie laboratoryjnym. Powodzenia!

Referencje:

Wprowadzenie do mikroskopii fluorescencyjnej. Nikon's MicroscopyU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . Dostęp 2021-04-11 17:20:40.

Mikroskopia: Jak naukowcy wykorzystują fluorescencję, aby zajrzeć do wnętrza komórek?

Zapisz się do naszego newslettera