Microscopie: Hoe wetenschappers fluorescentie gebruiken om in cellen te kijken -

Een groot deel van de routine van de wetenschapper bestaat uit het ontwerpen en uitvoeren van experimenten.

De combinatie van laboratoriumtechnieken zal de meeste vragen van wetenschappers beantwoorden, en de werkstroom om nieuwe methoden voor te stellen hangt af van de achtergrond en ervaring van de wetenschapper.

Voor biologen kunnen celbeelden veel zeggen over de processen en mechanismen die zij bestuderen.

Lichtmicroscopie is een zeer wijdverbreide techniek in de biologische wetenschappen.

Door het gebruik van kleurstoffen, antilichamen en fluorescerende sondes kunnen wetenschappers in de microscoopcellen beelden zien van wat anders te klein was om te zien en zelfs te bevatten.

Fluorescentiemicroscopen en het gebruik van fluorochromen werd mogelijk in 1930¹en tegenwoordig zijn vele combinaties van fluorochromen mogelijk om eiwitten, organellen en structuren in cellen en weefsels te kleuren.

Fluorochromen (of fluoroforen) zijn moleculen die bij prikkeling met een specifieke golflengte licht van een bepaalde golflengte uitzenden dat door de lenzen van een microscoop wordt opgevangen en omgezet in een werkelijk beeld.

De combinatie van fluorescentie, lenzen en camera's stelt ons in staat een beeld te maken van processen in cellen in vele verschillende aanzichten en aspecten.

Met de microscoop hebben we bijvoorbeeld een breder beeld van een plakje hersenen van een muis in een 2,5x of 4x objectief, en kleine details van het onderzochte actine cytoskelet in hetzelfde monster met een 63x objectief.

Om deze analyses mogelijk te maken, kunnen wij antilichamen of kleurstoffen tegen specifieke eiwitten in de cel of het weefsel gebruiken, en het antilichaam is meestal voorzien van een fluorofoor.

De verschuiving van Stokes verklaart dit verschijnsel: fluoroforen verliezen trillingsenergie in de vorm van uitgezonden licht wanneer zij van een aangeslagen toestand teruggaan naar de grondtoestand. Fluorescentiemicroscopen leveren het licht om de fluorofoor te exciteren, en ontvangen het uitgezonden licht. Het uitgezonden licht kan worden opgevangen door een lens, verwerkt in een CCD-camera en omgezet in een digitaal beeld.

Maar laten we het later hebben over het verwerven van celbeelden. Nu moeten we u voorbeelden en tips geven voor de belangrijkste stappen vóór de beeldvorming.

Hoe kiezen en combineren we verschillende soorten kleurstoffen en antilichamen om verbanden tussen organellen en eiwitten in cellen of weefsels te zien en te begrijpen?

Eerst moeten de wetenschappers op basis van hun onderzoek bepalen welke antilichamen en kleurstoffen ze gaan gebruiken.

Bijvoorbeeld, in dit artikelprobeerde Mendonça de effecten en mogelijke risico's van kationische nanopartikels met vaste lipiden (cSLN's) bij ratten te evalueren. Elk jaar worden vele nanodeeltjes ontwikkeld en bestudeerd, met als doel de afgifte van geneesmiddelen of genen voor de behandeling van vele ziekten te verbeteren. Een van de interessante vragen in deze studie was of de nanodeeltjes de hersenen konden bereiken door de bloed-hersenbarrière te passeren. Deze barrière beschermt onze hersenen tegen circulerende gifstoffen of ziekteverwekkers, en gewoonlijk is het niet wenselijk dat moleculen de barrière passeren. Maar in dit geval, Mendonça's Het doel was dat de nanodeeltjes de barrière zouden passeren en de hersenen zouden bereiken, om in een toekomstige toepassing geneesmiddelen of genen af te leveren.

Om te zien of de nanodeeltjes aanwezig waren in het hersenparenchym, gebruikten de auteurs een endotheelcelmerker voor de vaten, RECA-1 genaamd (weergegeven in rood), terwijl de celkernen werden gekleurd met een kleurstof genaamd DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindool), die blauw is. We kunnen ook kleine groene puntjes waarnemen voor de nanodeeltjes buiten de vaten, wat betekent dat zij het hersenparenchym hebben bereikt.

Bekijk hieronder de infographic met een representatieve afbeelding.

Mind the Graph infographic hoe je een panel ontwerpt voor immunofluorescentie

Laten we begrijpen wat het antilichaam voor RECA-1 (rood) doet.

Deze antilichamen zijn ontworpen als specifieke probes, en zij richten zich op een specifiek antigeen (in ons geval het eiwit RECA-1).

Zij kunnen worden gelabeld met een fluorofoor of later worden herkend door een secundair antilichaam gekoppeld aan een fluorofoor.

Daarom, na opwinding van het monster met een lichtbron, het specifieke eiwit dat u zoekt wordt in uw monster herkend door de emissie van licht in een specifieke golflengte.

In het geval van DAPI is deze kleurstof een tegenkleurstof voor kernen en nucleosomen, die blauw fluoresceren bij binding aan AT-gebieden van het DNA.

Hoe ontwerp je een panel voor immunofluorescentie?

Begin met deze stappen:

Koop (of leen! Wetenschap moet zeer collaboratief zijn!) antilichamen en kleurstoffen die essentieel zijn voor uw onderzoek. Geef de voorkeur aan primaire antilichamen (zonder probes), en koop secundaire antilichamen die specifiek zijn voor de gastheersoort van het primaire antilichaam. Als u bijvoorbeeld een primair antilichaam gebruikt dat bij konijnen is geproduceerd, gebruik dan een secundair antilichaam tegen konijnen. Dit garandeert specificiteit.
Het gebruik van secundaire antilichamen met fluoroforen versterkt uw signaal doordat meer antigenen per primair antilichaam worden gedetecteerd. Ook is dit een meer dynamische manier om verschillende assays uit te werken, omdat de onderzoeker de kleuren in het paneel kan wijzigen op basis van haar behoeften.
Een andere belangrijke stap is na te gaan welke filters in uw microscoop kunnen worden gebruikt. U moet ervoor zorgen dat de excitatie- en emissiegolflengte van uw fluorofoor binnen de excitatie- en emissiefilters liggen; anders kunt u het emissielicht van uw probes niet opvangen. U kunt gebruik maken van Fluorescentiespectra Viewer om de compatibiliteit te controleren.
Om ervoor te zorgen dat de excitatie- en emissiegolflengten van al uw fluoroforen en kleurstoffen elkaar niet overlappen binnen dezelfde assay, Fluorescentiespectra Viewer is een geweldige keuze. Ze dekken bijna alle beschikbare fluoroforen!

Bekijk tenslotte een voorbeeld van een hypothetisch experiment met Hoechst 33258 voor de nucleïnezuren, en een primair antilichaam tegen RECA-1 gelabeld met een secundair antilichaam Alexa Fluor 647.

Idealiter gebruiken wij een microscoop met een DAPI-blokje (excitatie 377/50 en emissie 447/60) en een CY5-blokje (excitatie 628/40 en emissie 685/40). Al deze informatie hebben wij opgenomen op Fluorescentiespectra Viewer en verkregen de spectra voor beide kleurstoffen, en de bandbreedtes voor beide kubussen (bekijk het spectrum in de infographic hierboven).

Dit hypothetische opstel is een goed voorbeeld waarbij de spectra van de fluoroforen in de excitatie- en emissiefilters thuishoren.

Nu is het tijd om naar het lab te gaan en alles in praktijk te brengen!

Ik hoop dat deze tips je helpen bij je volgende experiment. Veel succes!

Referenties:

Inleiding tot fluorescentiemicroscopie. Nikon's MicroscopieU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . Geraadpleegd 2021-04-11 17:20:40.

Microscopie: Hoe wetenschappers fluorescentie gebruiken om in cellen te kijken.

Abonneer u op onze nieuwsbrief