Mikroskopie: Jak vědci pomocí fluorescence nahlížejí do nitra buněk -

Velkou část práce vědce tvoří navrhování a provádění experimentů.

Kombinace laboratorních technik odpoví na většinu otázek navržených vědci a pracovní postup při navrhování nových metod závisí na vzdělání a zkušenostech vědce.

Obrázky buněk mohou biologům hodně napovědět o tom, co se děje s procesy a mechanismy, které studují.

Světelná mikroskopie je v biologických vědách velmi rozšířenou technikou.

Použití barviv, protilátek a fluorescenčních sond umožňuje vědcům vidět v buňkách mikroskopu obrazy toho, co by jinak bylo příliš malé na to, aby to bylo možné vidět a vůbec pochopit.

Fluorescenční mikroskopy a použití fluorochromů bylo možné v roce 1930¹, a dnes je možné barvit proteiny, organely a struktury v buňkách a tkáních mnoha kombinacemi fluorochromů.

Fluorochromy (nebo fluorofory) jsou molekuly, které po excitaci specifickou vlnovou délkou světla vyzařují světlo o definované vlnové délce, které zachytí čočky mikroskopu a přemění je na skutečný obraz.

Kombinace fluorescence, čoček a kamer nám umožňuje pořídit obraz procesů uvnitř buněk v mnoha různých pohledech a aspektech.

Pomocí mikroskopu máme například širší pohled na plátek myšího mozku v objektivu 2,5x nebo 4x a drobné detaily zkoumaného aktinového cytoskeletu ve stejném vzorku v objektivu 63x.

Pro tyto testy můžeme použít protilátky nebo barviva proti specifickým proteinům přítomným v buňce nebo tkáni, přičemž protilátka je obvykle opatřena fluoroforem.

Stokesův posun vysvětluje tento jev: fluorofory ztrácejí vibrační energii ve formě vyzařovaného světla, když se z excitovaného stavu vracejí zpět do základního stavu. Fluorescenční mikroskopy poskytnou světlo k excitaci fluoroforu a přijmou jeho emitované světlo. Emitované světlo lze zachytit objektivem, zpracovat v CCD kameře a převést na digitální obraz.

Ale o získávání snímků buněk si povíme později. Nyní bychom vás měli seznámit s příklady a tipy na hlavní kroky před pořízením snímku.

Jak vybíráme a kombinujeme různé typy barviv a protilátek, abychom viděli a pochopili vztahy mezi organelami a proteiny uvnitř buněk nebo tkání?

Nejprve musí vědci na základě svého výzkumu určit, které protilátky a barviva použijí.

Například, v tomto článkuMendonça se snažil vyhodnotit účinky a potenciální rizika kationických pevných lipidových nanočástic (cSLN) u potkanů. Každoročně je vyvíjeno a studováno mnoho nanočástic, jejichž cílem je zlepšit dodávku léčiv nebo genů pro léčbu mnoha nemocí. Jednou ze zajímavých otázek v této studii bylo, zda se nanočástice dokážou dostat do mozku překonáním hematoencefalické bariéry. Tato bariéra chrání náš mozek před cirkulujícími toxiny nebo patogeny a obvykle není žádoucí, aby molekuly tuto bariéru překračovaly. Ale v tomto konkrétním případě, Mendonça's Cílem bylo, aby nanočástice pronikly přes bariéru a dostaly se do mozku, kde by v budoucnu mohly být použity k dopravě léků nebo genů.

Autoři chtěli zjistit, zda jsou nanočástice přítomny v mozkovém parenchymu, a proto použili endoteliální buněčný marker pro cévy s názvem RECA-1 (znázorněný červeně), zatímco buněčná jádra byla obarvena barvivem DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol), které je modré. Můžeme také pozorovat malé zelené tečky pro nanočástice mimo cévy, což znamená, že se dostaly do mozkového parenchymu.

Podívejte se na níže uvedenou infografiku s reprezentativním obrázkem.

Mind the Graph infografika jak navrhnout panel pro imunofluorescenci

Pochopíme, co dělá protilátka proti RECA-1 (červená).

Tyto protilátky jsou navrženy tak, aby sloužily jako specifické sondy a byly zaměřeny na specifický antigen (v našem případě na protein RECA-1).

Mohou být označeny fluoroforem nebo později rozpoznány sekundární protilátkou navázanou na fluorofor.

Proto po excitaci vzorku světelným zdrojem, specifický protein, který hledáte, bude ve vzorku rozpoznán na základě emise světla specifické vlnové délky..

V případě DAPI je toto barvivo protibarvivem jader a nukleozomů a při vazbě na AT oblasti DNA emituje modrou fluorescenci.

Jak navrhnout panel pro imunofluorescenci?

Začněte těmito kroky:

Nakupte (nebo si půjčte! Věda by měla být velmi kooperativní!) protilátky a barviva nezbytná pro váš výzkum. Dávejte přednost primárním protilátkám (bez sond) a z primárních protilátek kupujte sekundární protilátky specifické pro hostitelský druh. Například pokud používáte primární protilátku vyrobenou u králíků, použijte sekundární protilátku proti králíkům. Tím zaručíte specifičnost.
Použití sekundárních protilátek značených fluorofory zvýší signál tím, že detekuje více antigenů na jednu primární protilátku. Rovněž se jedná o dynamičtější způsob vypracování různých testů, protože umožňuje výzkumníkovi měnit barvy v panelu na základě jeho potřeb.
Dalším důležitým krokem je zkontrolovat, jaké filtry lze v mikroskopu použít. Měli byste se ujistit, že excitační a emisní vlnová délka vašeho fluoroforu leží uvnitř excitačních a emisních filtrů; jinak nebudete moci zachytit emisní světlo vašich sond. Můžete použít Prohlížeč fluorescenčních spekter zkontrolovat kompatibilitu.
Ujistěte se, že se excitační a emisní vlnové délky všech vašich fluoroforů a barviv nepřekrývají v rámci jednoho testu, Prohlížeč fluorescenčních spekter je skvělou volbou. Pokrývají téměř všechny dostupné fluorofory!

Nakonec se podívejte na příklad hypotetického experimentu, kde máme pro nukleové kyseliny Hoechst 33258 a primární protilátku proti RECA-1 značenou sekundární protilátkou Alexa Fluor 647.

V ideálním případě bychom použili mikroskop s kostkou DAPI (excitace 377/50 a emise 447/60) a kostkou CY5 (excitace 628/40 a emise 685/40). Všechny tyto informace jsme vložili na Prohlížeč fluorescenčních spekter a získal spektra obou barviv a šířky pásma pro obě kostky (podívejte se na spektra v infografice výše).

Tato hypotetická esej je dobrým příkladem toho, že spektra fluoroforů patří do excitačního a emisního filtru, což umožňuje výzkumníkovi co nejlépe zachytit jeho vzorky.

Nyní je čas jít do laboratoře a vše vyzkoušet v praxi!

Doufám, že vám tyto tipy pomohou při vašem dalším laboratorním experimentu. Hodně štěstí!

Odkazy:

Úvod do fluorescenční mikroskopie. MikroskopieU společnosti Nikon https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . Přístup 2021-04-11 17:20:40.

Mikroskopie: Jak vědci pomocí fluorescence nahlížejí do nitra buněk?

Přihlaste se k odběru našeho newsletteru