Mikroskopija: Kako znanstveniki s pomočjo fluorescence vidijo notranjost celic -

Velik del znanstvenikovega dela je načrtovanje in izvajanje poskusov.

Kombinacija laboratorijskih tehnik bo odgovorila na večino vprašanj, ki jih predlagajo znanstveniki, potek dela za predlaganje novih metod pa je odvisen od znanstvenikovega predznanja in izkušenj.

Slike celic lahko biologom veliko povedo o dogajanju v procesih in mehanizmih, ki jih preučujejo.

Svetlobna mikroskopija je zelo razširjena tehnika v bioloških znanostih.

Uporaba barvil, protiteles in fluorescenčnih sond znanstvenikom omogoča, da v celicah mikroskopa vidijo slike, ki so sicer premajhne, da bi jih lahko videli in celo razumeli.

Fluorescenčni mikroskopi in uporabo fluorohromov postala mogoča leta 1930.¹, danes pa so možne številne kombinacije fluorohromov za barvanje proteinov, organelov ter struktur v celicah in tkivih.

Fluorohromi (ali fluorofori) so molekule, ki ob vzbujanju svetlobe določene valovne dolžine oddajajo svetlobo določene valovne dolžine, ki jo zajamejo leče mikroskopa in pretvorijo v dejansko sliko.

Kombinacija fluorescence, leč in kamer nam omogoča, da posnamemo slike procesov v celicah z različnih vidikov.

Z mikroskopom imamo na primer širši pogled na rezino mišjih možganov z 2,5-kratnim ali 4-kratnim objektivom, z 63-kratnim objektivom pa lahko v istem vzorcu opazujemo majhne podrobnosti o proučevanem aktinskem citoskeletu.

Za te teste lahko uporabimo protitelesa ali barvila proti specifičnim proteinom, ki so prisotni v celici ali tkivu, protitelesa pa so običajno opremljena s fluoroforjem.

Stokesov premik pojasnjuje ta pojav: fluorofori izgubijo vibracijsko energijo v obliki oddane svetlobe, ko preidejo iz vzbujenega stanja nazaj v osnovno stanje. Fluorescenčni mikroskopi zagotavljajo svetlobo za vzbujanje fluorofora in sprejemajo njegovo oddano svetlobo. Emitirano svetlobo je mogoče zajeti z objektivom, obdelati v kameri CCD in pretvoriti v digitalno sliko.

O pridobivanju slik celic pa bomo govorili pozneje. Zdaj vam moramo predstaviti primere in nasvete za glavne korake pred pridobivanjem slike.

Kako izberemo in kombiniramo različne vrste barvil in protiteles, da vidimo in razumemo odnose med organeli in proteini v celicah ali tkivih?

Znanstveniki morajo najprej določiti, katera protitelesa in barvila bodo uporabili na podlagi svojih raziskav.

Na primer, v tem člankuMendonça je poskušal oceniti učinke in morebitna tveganja kationskih trdnih lipidnih nanodelcev (cSLN) pri podganah. Vsako leto se razvijajo in preučujejo številni nanodelci, katerih cilj je izboljšati dostavo zdravil ali genov za zdravljenje številnih bolezni. Eno od zanimivih vprašanj v tej študiji je bilo, ali lahko nanodelci dosežejo možgane, tako da prečkajo krvno-možgansko pregrado. Ta pregrada varuje naše možgane pred krožečimi toksini ali patogeni in običajno ni zaželeno, da bi molekule prečkale to pregrado. Toda v tem posebnem primeru, Mendonça's cilj je bil, da nanodelci prestopijo pregrado in dosežejo možgane, da bi lahko v prihodnosti uporabljali zdravila ali gene.

Ker so želeli preveriti, ali so nanodelci prisotni v možganskem parenhimu, so avtorji uporabili označevalec endotelijskih celic za žile, imenovan RECA-1 (prikazan z rdečo barvo), medtem ko so celična jedra obarvali z barvilom DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol), ki je modre barve. Opazimo lahko tudi majhne zelene pike za nanodelce zunaj žil, kar pomeni, da so dosegli možganski parenhim.

Oglejte si spodnjo infografiko s predstavitveno sliko.

Mind the Graph infografika Kako oblikovati panel za imunofluorescenco

Razumemo, kaj počne protitelo za RECA-1 (rdeče).

Ta protitelesa so zasnovana kot specifične sonde in so usmerjena proti specifičnemu antigenu (v našem primeru proti beljakovini RECA-1).

Označimo jih lahko s fluoroforjem ali jih kasneje prepoznamo s sekundarnim protitelesom, povezanim s fluoroforjem.

Zato po vzbujanju vzorca z virom svetlobe, določen protein, ki ga iščete, bo v vašem vzorcu prepoznan po oddajanju svetlobe določene valovne dolžine..

V primeru DAPI je to barvilo kontrastin za jedra in nukleosome in oddaja modro fluorescenco, ko se veže na območja AT v DNK.

Kako oblikovati panel za imunofluorescenco?

Začnite s temi koraki:

Kupite (ali si izposodite! Znanost mora biti zelo sodelovalna!) protitelesa in barvila, potrebna za vaše raziskave. Prednost dajte primarnim protitelesom (brez sond), od primarnega protitelesa pa kupite sekundarna protitelesa, specifična za gostiteljsko vrsto. Če na primer uporabljate primarno protitelo, proizvedeno pri kuncih, uporabite sekundarno protitelo za anti-krabico. To bo zagotovilo specifičnost.
Uporaba sekundarnih protiteles, označenih s fluorofori, bo povečala vaš signal z zaznavanjem več antigenov na primarno protitelo. To je tudi bolj dinamičen način za pripravo različnih testov, saj raziskovalcu omogoča, da spreminja barve v panelu glede na svoje potrebe.
Drug pomemben korak je, da v svojem mikroskopu preverite, kateri filtri so na voljo za uporabo. Prepričajte se, da valovni dolžini vzbujanja in oddajanja fluorofora ležita znotraj filtrov za vzbujanje in oddajanje, sicer ne boste mogli zajeti svetlobe oddajanja vaših sond. Uporabite lahko Pregledovalnik fluorescenčnih spektrov za preverjanje združljivosti.
Prepričajte se, da se valovne dolžine ekscitacije in emisije vseh vaših fluoroforjev in barvil ne prekrivajo znotraj istega testa, Pregledovalnik fluorescenčnih spektrov je odlična izbira. Pokrivajo skoraj vse razpoložljive fluorofore!

Na koncu preverite primer hipotetičnega poskusa, v katerem imamo Hoechst 33258 za nukleinske kisline in primarno protitelo proti RECA-1, označeno s sekundarnim protitelesom Alexa Fluor 647.

Najbolje bi bilo uporabiti mikroskop, ki ima na voljo kocko DAPI (ekscitacija 377/50 in emisija 447/60) in kocko CY5 (ekscitacija 628/40 in emisija 685/40). Vse te informacije smo vstavili na Pregledovalnik fluorescenčnih spektrov in pridobili spektre obeh barvil ter pasovne širine obeh kock (oglejte si spekter v zgornji infografiki).

Ta hipotetični esej je dober primer, kjer spektri fluoroforjev spadajo v vzbujalni in emisijski filter, kar raziskovalcu omogoča, da svoje vzorce zajame na najboljši možni način.

Zdaj je čas, da se odpravite v laboratorij in vse skupaj uporabite v praksi!

Upam, da vam bodo ti nasveti pomagali pri naslednjem laboratorijskem poskusu. Veliko sreče!

Reference:

Uvod v fluorescenčno mikroskopijo. Nikonova mikroskopijaU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . Dostopno 2021-04-11 17:20:40.

Mikroskopija: Kako znanstveniki s pomočjo fluorescence vidijo notranjost celic

Naročite se na naše novice