En stor del av forskerens arbeid består i å designe og utføre eksperimenter.

The combination of laboratory techniques will answer most of the questions proposed by scientists, and the workflow to suggest new methods depends on the scientist’s background and experience.

For biologer kan cellebilder si mye om hva som skjer med prosessene og mekanismene de studerer.

Lysmikroskopi er en svært utbredt teknikk innen biologiske vitenskaper.

The use of dyes, antibodies, and fluorescent probes allows scientists to see in the microscope cells images of what was otherwise too small to be seen and even comprehended.

Fluorescensmikroskoper og bruk av fluorokromer ble mulig i 19301I dag finnes det mange kombinasjoner av fluorokromer som kan brukes til å farge proteiner, organeller og strukturer i celler og vev.

Fluorokromer (eller fluoroforer) er molekyler som når de eksiteres med en bestemt bølgelengde, sender ut lys med en definert bølgelengde som fanges opp av linsene i et mikroskop og omdannes til et faktisk bilde.

Kombinasjonen av fluorescens, linser og kameraer gjør det mulig å avbilde prosesser inne i celler fra mange ulike vinkler og aspekter.

Ved hjelp av mikroskopet kan vi for eksempel se et større bilde av et snitt av en musehjerne i et 2,5x- eller 4x-objektiv, og små detaljer av det undersøkte aktincytoskjelettet i den samme prøven med et 63x-objektiv.

For å muliggjøre disse analysene kan vi bruke antistoffer eller fargestoffer mot spesifikke proteiner i cellen eller vevet, og antistoffet er vanligvis utstyrt med en fluorofor.

Stokes' skift forklarer dette fenomenet: Fluoroforer mister vibrasjonsenergi i form av utsendt lys når de går fra en eksitert tilstand tilbake til grunntilstanden. Fluorescensmikroskoper gir lys til å eksitere fluoroforen, og mottar det utsendte lyset. Det utsendte lyset kan fanges opp av en linse, behandles i et CCD-kamera og omdannes til et digitalt bilde.

Men la oss snakke om cellebildeopptak senere. Nå skal vi gi deg eksempler og tips til de viktigste trinnene før du tar bildet.

How do we choose and combine different types of dyes and antibodies, to see and understand relationships between organelles and proteins inside cells or tissues?

First, scientists need to determine which antibodies and dyes to use based on their research.

For eksempel, i denne artikkelenMendonça forsøkte å evaluere effektene og de potensielle risikoene ved kationiske faste lipidnanopartikler (cSLN) i rotter. Mange nanopartikler utvikles og studeres hvert år, med sikte på å forbedre tilførselen av legemidler eller gener for å behandle mange sykdommer. Et av de interessante spørsmålene i denne studien var om nanopartiklene var i stand til å nå hjernen ved å krysse blod-hjerne-barrieren. Denne barrieren beskytter hjernen vår mot sirkulerende giftstoffer eller patogener, og vanligvis er det ikke ønskelig at molekyler krysser barrieren. Men i dette spesielle tilfellet Mendonça's Målet var at nanopartiklene skulle krysse barrieren og nå frem til hjernen for å kunne levere legemidler eller gener i en fremtidig applikasjon.

For å se om nanopartiklene var til stede i hjernens parenkym, brukte forfatterne en endotelcellemarkør for karene som heter RECA-1 (representert i rødt), mens cellekjernene ble farget med et fargestoff som heter DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol), som er blått. Vi kan også observere små grønne prikker for nanopartiklene utenfor karene, noe som betyr at de nådde inn i hjerneparenkymet.

Check out the infographic below with a representation image.

Mind the Graph-infografikk om hvordan du utformer et panel for immunfluorescens

La oss forstå hva antistoffet for RECA-1 (rødt) gjør.

These antibodies are designed to serve as specific probes, and they target a specific antigen (in our case, the protein RECA-1).

De kan merkes med en fluorofor eller gjenkjennes senere av et sekundært antistoff som er koblet til en fluorofor.

Derfor, etter at prøven er blitt tent med en lyskilde, det spesifikke proteinet du leter etter, gjenkjennes i prøven ved at det avgir lys med en bestemt bølgelengde..

Når det gjelder DAPI, er dette fargestoffet et motfargestoff for kjerner og nukleosomer, og det avgir blå fluorescens når det binder seg til AT-områder i DNA.

Hvordan utforme et panel for immunfluorescens?

Begynn med disse trinnene:

  1. Buy (or borrow! Science should be very collaborative!) antibodies and dyes essential for your research. Give preference to primary antibodies (without probes), and buy secondary antibodies specific for the host species from the primary antibody. For example, if using a primary antibody produced in rabbits, use a secondary antibody for anti-rabbit. This will guarantee specificity. 
  2. Ved å bruke sekundære antistoffer som er merket med fluoroforer, kan du forsterke signalet ved å detektere flere antigener per primært antistoff. Dette er også en mer dynamisk måte å utvikle ulike analyser på, fordi forskeren kan endre fargene i panelet etter behov. 
  3. Et annet viktig trinn er å sjekke hvilke filtre som er tilgjengelige i mikroskopet. Du må sørge for at eksitasjons- og emisjonsbølgelengdene for fluoroforene ligger innenfor eksitasjons- og emisjonsfiltrene, ellers vil du ikke kunne fange opp emisjonslyset fra probene. Du kan bruke Visning av fluorescensspektre for å sjekke kompatibiliteten.
  4. Sørg for at eksitasjons- og emisjonsbølgelengdene til alle fluoroforene og fargestoffene ikke overlapper hverandre i samme analyse, Visning av fluorescensspektre er et godt valg. De dekker nesten alle tilgjengelige fluoroforer!

Sjekk til slutt et eksempel på et hypotetisk eksperiment der vi har Hoechst 33258 for nukleinsyrene og et primært antistoff mot RECA-1 merket med et sekundært antistoff Alexa Fluor 647.

Ideelt sett ville vi brukt et mikroskop med en DAPI-kube (eksitasjon 377/50 og emisjon 447/60) og en CY5-kube (eksitasjon 628/40 og emisjon 685/40). All denne informasjonen har vi lagt inn på Visning av fluorescensspektre og fikk spektrene for begge fargestoffene og båndbreddene for begge kubene (se spektret i infografikken over).

Dette hypotetiske essayet er et godt eksempel på at fluoroforenes spektre hører hjemme innenfor eksitasjons- og emisjonsfiltrene, noe som gjør det mulig for forskeren å fange opp prøvene sine på best mulig måte.

Nå er det på tide å gå til laboratoriet og sette alt i praksis!

Jeg håper disse tipsene kan hjelpe deg med ditt neste laboratorieforsøk. Lykke til!

Referanser:

  1. Introduksjon til fluorescensmikroskopi. Nikons MicroscopyU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy. Besøkt 2021-04-11 17:20:40.
Relaterte artikler
logo-abonnement

Abonner på nyhetsbrevet vårt

Eksklusivt innhold av høy kvalitet om effektiv visuell
kommunikasjon innen vitenskap.

- Eksklusiv guide
- Tips om design
- Vitenskapelige nyheter og trender
- Veiledninger og maler