O mare parte din rutina omului de știință constă în conceperea și efectuarea de experimente.

Combinația de tehnici de laborator va răspunde la majoritatea întrebărilor propuse de oamenii de știință, iar fluxul de lucru pentru a sugera noi metode depinde de pregătirea și experiența cercetătorului.

Pentru biologi, imaginile celulelor pot spune multe despre ceea ce se întâmplă cu procesele și mecanismele pe care le studiază.

Microscopie de lumină este o tehnică foarte răspândită în științele biologice.

Utilizarea coloranților, a anticorpilor și a sondelor fluorescente le permite oamenilor de știință să vadă în celulele microscopului imagini a ceea ce altfel era prea mic pentru a fi văzut și chiar înțeles.

Microscoape cu fluorescență și utilizarea de fluorocromi a devenit posibilă în 19301, iar astăzi sunt posibile multe combinații de fluorocromi pentru a colora proteine, organite și structuri din celule și țesuturi.

Fluorocromi (sau fluorofori) sunt molecule care, atunci când sunt excitate cu o anumită lungime de undă de lumină, emit lumină cu o lungime de undă definită care va fi captată de lentilele unui microscop și transformată într-o imagine reală.

Combinația dintre fluorescență, lentile și camere ne permite să obținem o imagine a proceselor din interiorul celulelor din mai multe perspective și aspecte diferite.

De exemplu, cu ajutorul microscopului, avem o vedere mai amplă a unei felii de creier de șoarece cu un obiectiv de 2,5x sau 4x și detalii mici ale citoscheletului de actină sondat în aceeași probă cu un obiectiv de 63x.

Pentru a permite aceste teste, putem folosi anticorpi sau coloranți împotriva unor proteine specifice prezente în celule sau țesuturi, iar anticorpul este de obicei însoțit de un fluorofor.

Schimbarea lui Stokes explică acest fenomen: fluoroforii pierd energie vibrațională sub formă de lumină emisă atunci când trec de la o stare excitată la starea fundamentală. Microscoapele cu fluorescență vor furniza lumina pentru a excita fluoroforul și vor primi lumina emisă de acesta. Lumina emisă poate fi captată de o lentilă, procesată în interiorul unei camere CCD și transformată într-o imagine digitală.

Dar să vorbim mai târziu despre achiziția de imagini celulare. Acum, ar trebui să vă prezentăm exemple și sfaturi pentru principalii pași înainte de achiziția imaginii.

Cum alegem și combinăm diferite tipuri de coloranți și anticorpi pentru a vedea și înțelege relațiile dintre organite și proteine din interiorul celulelor sau țesuturilor?

În primul rând, oamenii de știință trebuie să stabilească ce anticorpi și coloranți să folosească pe baza cercetărilor lor.

De exemplu, în acest articol, Mendonça a încercat să evalueze efectele și riscurile potențiale ale nanoparticulelor de lipide solide cationice (cSLN) la șobolani. Multe nanoparticule sunt dezvoltate și studiate în fiecare an, cu scopul de a îmbunătăți livrarea de medicamente sau gene pentru a trata numeroase boli. Una dintre întrebările interesante din acest studiu a fost dacă nanoparticulele au fost capabile să ajungă la creier prin traversarea barierei hemato-encefalice. Această barieră ne protejează creierul de toxinele sau agenții patogeni care circulă și, de obicei, nu este de dorit ca moleculele să traverseze bariera. Dar în acest caz particular, Mendonça's Scopul a fost ca nanoparticulele să traverseze bariera și să ajungă la creier, pentru a livra medicamente sau gene într-o aplicație viitoare.

Dorind să vadă dacă nanoparticulele erau prezente în parenchimul cerebral, autorii au folosit un marker al celulelor endoteliale pentru vase numit RECA-1 (reprezentat în roșu), în timp ce nucleele celulelor au fost colorate cu un colorant numit DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol), care este albastru. De asemenea, putem observa mici puncte verzi pentru nanoparticulele din afara vaselor, ceea ce înseamnă că acestea au ajuns în parenchimul cerebral.

Consultați infograficul de mai jos cu o imagine de reprezentare.

Infografic Mind the Graph cum să concepeți un panou pentru imunofluorescență

Să înțelegem ce face anticorpul pentru RECA-1 (roșu).

Acești anticorpi sunt concepuți pentru a servi ca sonde specifice și vizează un antigen specific (în cazul nostru, proteina RECA-1).

Acestea pot fi marcate cu un fluorofor sau pot fi recunoscute ulterior de un anticorp secundar legat de un fluorofor.

Prin urmare, după excitarea probei cu o sursă de lumină, proteina specifică pe care o căutați va fi recunoscută în proba dumneavoastră prin emisia de lumină într-o anumită lungime de undă..

În cazul DAPI, acest colorant este un contracolorant pentru nuclei și nucleozomi și emite fluorescență albastră atunci când se leagă de regiunile AT ale ADN-ului.

Cum se proiectează un panel pentru imunofluorescență?

Începeți cu acești pași:

  1. Cumpărați (sau împrumutați! Știința ar trebui să fie foarte colaborativă!) anticorpi și coloranți esențiali pentru cercetarea dumneavoastră. Dați preferință anticorpilor primari (fără sonde) și cumpărați anticorpi secundari specifici pentru specia gazdă din anticorpul primar. De exemplu, dacă folosiți un anticorp primar produs la iepuri, utilizați un anticorp secundar pentru anti-iepure. Acest lucru va garanta specificitatea. 
  2. Utilizarea anticorpilor secundari marcați cu fluorofori va spori semnalul prin detectarea mai multor antigene pentru fiecare anticorp primar. De asemenea, acesta este un mod mai dinamic de a elabora diferite teste, deoarece permite cercetătorului să modifice culorile din panou în funcție de nevoile sale. 
  3. Un alt pas important este să verificați în cadrul microscopului dumneavoastră ce filtre sunt disponibile pentru utilizare. Trebuie să vă asigurați că lungimile de undă de excitație și de emisie ale fluoroforilor dvs. se află în interiorul filtrelor de excitație și de emisie; în caz contrar, nu veți putea capta lumina de emisie de la sondele dvs. Puteți utiliza Vizualizator de spectre de fluorescență pentru a verifica compatibilitatea.
  4. Pentru a vă asigura că lungimile de undă de excitație și de emisie ale tuturor fluoroforilor și coloranților dvs. nu se suprapun în cadrul aceluiași test, Vizualizator de spectre de fluorescență este o alegere excelentă. Acestea acoperă aproape toți fluoroforii disponibili!

În cele din urmă, verificați un exemplu pentru un experiment ipotetic în care avem Hoechst 33258 pentru acizii nucleici și un anticorp primar împotriva RECA-1 marcat cu un anticorp secundar Alexa Fluor 647.

Ideal ar fi să folosim un microscop disponibil cu un cub DAPI (excitație 377/50 și emisie 447/60) și un cub CY5 (excitație 628/40 și emisie 685/40). Toate aceste informații le-am inserat la Vizualizator de spectre de fluorescență și am obținut spectrele pentru ambii coloranți și lățimile de bandă pentru ambele cuburi (consultați spectrul în infograficul de mai sus).

Acest eseu ipotetic este un bun exemplu în care spectrele fluoroforilor se află în interiorul filtrelor de excitație și de emisie, ceea ce permite cercetătorului să capteze eșantioanele sale în cel mai bun mod posibil.

Acum, este timpul să mergem în laborator și să punem totul în practică!

Sper ca aceste sfaturi să vă ajute în următorul experiment de laborator. Mult noroc!

Referințe:

  1. Introducere în microscopia de fluorescență. Microscopia Nikon's MicroscopyU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy. Accesat în 2021-04-11 17:20:40.
Articole conexe
logo-abonare

Abonează-te la newsletter-ul nostru

Conținut exclusiv de înaltă calitate despre vizuale eficiente
comunicarea în domeniul științei.

- Ghid exclusiv
- Sfaturi de design
- Știri și tendințe științifice
- Tutoriale și șabloane