Bilim insanının rutininin büyük bir kısmı deneyler tasarlamak ve gerçekleştirmektir.
Laboratuvar tekniklerinin kombinasyonu, bilim insanları tarafından önerilen soruların çoğuna cevap verecektir ve yeni yöntemler önermek için iş akışı bilim insanının geçmişine ve deneyimine bağlıdır.
Biyologlar için hücre görüntüleri, üzerinde çalıştıkları süreç ve mekanizmalarda neler olup bittiği hakkında çok şey söyleyebilir.
Işık mikroskobu biyolojik bilimlerde çok yaygın bir tekniktir.
Boyaların, antikorların ve floresan probların kullanımı, bilim insanlarının mikroskop hücrelerinde, aksi takdirde görülemeyecek ve hatta anlaşılamayacak kadar küçük olan görüntüleri görmelerini sağlar.
Floresan mikroskoplar ve florokromların kullanımı 1930'da mümkün oldu1ve günümüzde proteinleri, organelleri ve hücre ve dokulardaki yapıları boyamak için birçok florokrom kombinasyonu mümkündür.
Florokromlar (veya floroforlar) belirli bir dalga boyunda ışıkla uyarıldığında, mikroskop mercekleri tarafından yakalanacak ve gerçek bir görüntüye dönüştürülecek olan tanımlanmış bir dalga boyunda ışık yayan moleküllerdir.
Floresan, lensler ve kameraların kombinasyonu, hücrelerin içindeki süreçlerin birçok farklı görünüm ve açıdan görüntüsünü almamızı sağlar.
Örneğin, mikroskobu kullanarak, 2,5x veya 4x objektifte bir fare beyin diliminin daha geniş bir görüntüsüne ve 63x objektif kullanarak aynı örnekte problanan aktin hücre iskeletinin küçük ayrıntılarına sahibiz.
Bu analizleri mümkün kılmak için, hücre veya dokuda bulunan spesifik proteinlere karşı antikorlar veya boyalar kullanabiliriz ve antikor genellikle bir florofor ile birlikte gelir.
Stokes kayması bu fenomeni açıklar: floroforlar uyarılmış bir durumdan temel duruma geri döndüklerinde yayılan ışık şeklinde titreşimsel enerji kaybederler. Floresan mikroskopları floroforu uyarmak için ışık sağlar ve yayılan ışığı alır. Yayılan ışık bir lens tarafından yakalanabilir, bir CCD kamera içinde işlenebilir ve dijital bir görüntüye dönüştürülebilir.
Ancak hücre görüntüsü alma konusunu daha sonra konuşalım. Şimdi, görüntünüzü almadan önceki ana adımlar için size örnekler ve ipuçları sunmalıyız.
Hücreler veya dokular içindeki organeller ve proteinler arasındaki ilişkileri görmek ve anlamak için farklı boya ve antikor türlerini nasıl seçer ve birleştiririz?
Öncelikle, bilim insanlarının araştırmalarına dayanarak hangi antikorları ve boyaları kullanacaklarını belirlemeleri gerekir.
Örneğin, bu makaledeMendonça, katyonik katı lipid nanopartiküllerin (cSLN'ler) sıçanlardaki etkilerini ve potansiyel risklerini değerlendirmeye çalışıyordu. Her yıl birçok hastalığın tedavisi için ilaçların veya genlerin iletimini artırmayı amaçlayan birçok nanopartikül geliştirilmekte ve üzerinde çalışılmaktadır. Bu çalışmadaki ilginç sorulardan biri, nanopartiküllerin kan-beyin bariyerini geçerek beyne ulaşıp ulaşamayacağıydı. Bu bariyer beynimizi dolaşımdaki toksinlerden veya patojenlerden korur ve genellikle moleküllerin bariyeri geçmesi istenmez. Ancak bu özel durumda, Mendonça'nın Amaç, nanopartiküllerin bariyeri geçerek beyne ulaşması ve gelecekteki bir uygulamada ilaç veya genleri iletmesiydi.
Nanopartiküllerin beyin parankiminde mevcut olup olmadığını görmek isteyen yazarlar, damarlar için RECA-1 (kırmızı ile temsil edilir) adı verilen bir endotel hücre işaretleyicisi kullanırken, hücre çekirdekleri DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) adı verilen mavi bir boya ile boyandı. Damarların dışındaki nanopartiküller için küçük yeşil noktalar da gözlemleyebiliyoruz, bu da beyin parankimine ulaştıkları anlamına geliyor.
Temsili bir görüntü ile aşağıdaki bilgi grafiğine göz atın.
RECA-1 (kırmızı) antikorunun ne yaptığını anlayalım.
Bu antikorlar spesifik problar olarak tasarlanmıştır ve spesifik bir antijeni hedef alırlar (bizim durumumuzda RECA-1 proteini).
Bunlar bir florofor ile etiketlenebilir veya daha sonra bir florofora bağlı ikincil bir antikor tarafından tanınabilir.
Bu nedenle, numune bir ışık kaynağı ile uyarıldıktan sonra, Aradığınız spesifik protein, numunenizde belirli bir dalga boyunda ışık emisyonu ile tanınacaktır.
DAPI durumunda, bu boya çekirdek ve nükleozom karşı boyasıdır ve DNA'nın AT bölgelerine bağlandığında mavi floresan yayar.
İmmünofloresan için bir panel nasıl tasarlanır?
Bu adımlarla başlayın:
- Araştırmanız için gerekli olan antikorları ve boyaları satın alın (veya ödünç alın! Bilim çok işbirlikçi olmalıdır!). Birincil antikorları (problar olmadan) tercih edin ve birincil antikordan konakçı türe özgü ikincil antikorlar satın alın. Örneğin, tavşanlarda üretilen bir birincil antikor kullanıyorsanız, anti-tavşan için ikincil bir antikor kullanın. Bu özgüllüğü garanti edecektir.
- Floroforlarla etiketlenmiş ikincil antikorların kullanılması, birincil antikor başına daha fazla antijen tespit ederek sinyalinizi artıracaktır. Ayrıca bu, farklı analizleri detaylandırmak için daha dinamik bir yoldur, çünkü araştırmacının ihtiyaçlarına göre paneldeki renkleri değiştirmesine olanak tanır.
- Bir diğer önemli adım da mikroskobunuzda hangi filtrelerin kullanılabileceğini kontrol etmektir. Florofor uyarma ve emisyon dalga boylarınızın uyarma ve emisyon filtrelerinin içinde olduğundan emin olmalısınız; aksi takdirde problarınızdan gelen emisyon ışığını yakalayamazsınız. Kullanabileceğiniz Floresan Spektrum Görüntüleyici uyumluluğu kontrol etmek için.
- Tüm florofor ve boyalarınızın uyarma ve emisyon dalga boylarının aynı tahlil içinde çakışmadığından emin olmak için, Floresan Spektrum Görüntüleyici harika bir seçimdir. Neredeyse mevcut tüm floroforları kapsıyorlar!
Son olarak, nükleik asitler için Hoechst 33258 ve ikincil antikor Alexa Fluor 647 ile etiketlenmiş RECA-1'e karşı bir birincil antikora sahip olduğumuz varsayımsal bir deney için bir örneği kontrol edin.
İdeal olarak, bir DAPI küpü (eksitasyon 377/50 ve emisyon 447/60) ve bir CY5 küpü (eksitasyon 628/40 ve emisyon 685/40) bulunan bir mikroskop kullanırdık. Eklediğimiz tüm bu bilgiler Floresan Spektrum Görüntüleyici ve her iki boya için spektrumları ve her iki küp için bant genişliklerini elde etti (yukarıdaki infografikte spektruma göz atın).
Bu varsayımsal makale, floroforların spektrumlarının uyarma ve emisyon filtrelerinin içine ait olduğu ve araştırmacının örneklerini mümkün olan en iyi şekilde yakalamasını mümkün kılan iyi bir örnektir.
Şimdi, laboratuvara gitme ve her şeyi uygulamaya koyma zamanı!
Umarım bu ipuçları bir sonraki laboratuvar deneyinizde size yardımcı olur. İyi şanslar!
Referanslar:
- Floresan Mikroskopisine Giriş. Nikon'un MikroskopiU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy. Erişim 2021-04-11 17:20:40.
Haber bültenimize abone olun
Etkili görseller hakkında özel yüksek kaliteli içerik
bilimde iletişim.
Turkish 
English 
Chinese 
Czech 
Dutch 
French 
German 
Italian 
Indonesian 
Japanese 
Korean 
Polish 
Portuguese 
Russian 
Spanish 
Ukrainian 
Swedish 
Romanian 
Bulgarian 
Finnish 
Greek 
Hungarian 
Norwegian 
Danish 
Estonian 
Slovenian 
Lithuanian 
Latvian 
Slovak