RT-PCR-test för coronaviruset

Av allt du har hört om covid-19 under 2020 är det en sak som står i centrum: det test som används för att upptäcka om någon är smittad av viruset, det berömda RT-PCR-testet eller bara PCR.

Du har säkert redan hört talas om detta test tidigare, från en läkare eller i nyheterna. PCR-testet används för att upptäcka om viruset finns (eller inte finns) i någons kropp.

RT-PCR-testet är inte det enda som kan påvisa viruset, men jämfört med andra metoder är det det mest exakta och tillförlitliga. Ett annat test är det konventionella serologiska testet som detekterar specifika antikroppsnivåer i blodprover.

Bokstäverna i RT-PCR står för Polymeraskedjereaktion med omvänd transkriptionDen har använts i årtionden av forskare för att framställa flera kopior av genetiskt material.

Med andra ord, i detta fall mer genetiskt material från SARS-CoV-2, som används som fingeravtryck för att bekräfta förekomsten av viruset i prover från näsa, öron eller saliv som samlats in från patienter. Om det finns några virus dolda i provet, även i små mängder, kommer det att kunna upptäckas på grund av dess copy-paste-cykel. Det är därför RT-PCR-testet är så tillförlitligt.

Testet är en metod med i princip två steg i en temperaturcykel, där man kopierar och klistrar in en bit genetiskt material, antingen DNA eller RNA.

Testet kräver en maskin för termocykling som har en exakt temperatur- och tidsstyrning. Genom flera temperaturcykler kommer virusets genetiska material att öka. Ett exempel på en temperaturcykel visas här intill.

Metoden kräver två huvudsakliga enzymer, det omvända transkriptaset (därav "RT" i titeln) och DNA-polymeraset. Vart och ett av dem har en verkningsfas och en funktion. I figuren ovan är den gula fasen i cykeln när RT agerar och den röda fasen när DNA-polymeraset gör sitt jobb.

Det första enzymet tillverkar den komplementära DNA-strängen från RNA-viruset, vilket gör det möjligt för det andra enzymet att utföra arbetet med att kopiera och klistra in från den nya DNA-strängen, vilket ökar mängden genetiskt material. Denna amplifiering gör det möjligt att karakterisera och/eller manipulera det genetiska materialet, vilket inte skulle vara möjligt i en mindre mängd.

För att allt detta skall kunna ske behöver enzymerna hjälp av en liten (eller stor) molekyl som kallas PRIMER. Primerns funktion är att ange den plats där enzymet ska börja förlänga strängarna, utan den kommer DNA-polymerasets copy-paste-process inte att starta.

Primern kan väljas med en slumpmässig eller en specifik form. Det är mycket viktigt att känna till vírus genetiska karta i fall som detta, så att specifika primes kan användas för att öka effektiviteten och tillförlitligheten i resultaten.

Om du är nyfiken som vi och vill veta mer om RT-PCR kan du läsa mer här denna vetenskapliga artikel här men i huvudsak finns här allt som behövs för att göra testet:

Virusets genetiska material, RNA

Omvänt transkriptas och DNA-polymerasenzymer

PRIMÄRER

Nukleosidtrifosfater

Och fluorescerande rapporteringsfärgämnen:

För att veta resultatet av ett prov som eventuellt är kontaminerat med covid-19-virus används fluorescerande reporterfärgämnen i kombination med RT-PCR-testet. Analysen baseras på närvaron eller frånvaron av ett provs fluorescerande signal. Om det inte finns någon signal kan testet bedömas som negativt eller falskt negativt. Vid förekomst av en intensiv signal kan testet inte bara anses vara positivt för förekomst av vírus utan också som ett avancerat stadium av sjukdomen.

Blanda alla ingredienser och lägg det i termocykelmaskinen.

Testets första steg visas i infografiken här intill. RT-enzymet gör den första kopian av det genetiska materialet hos det virus som finns i provet. Därefter visas det andra steget i RT-PCR-metoden. Primern anger startpositionen och DNA-polymeraset börjar genom enzymatisk reaktion att förlänga DNA-strängarna.

Slutligen är denna bild en elektronmikroskopisk bild av SARS-CoV-2-viruset, och det är möjligt att se virusets struktur perfekt. Visst är det vackert?

Testet är komplext och inte så enkelt som det verkar, men jag slår vad om att det var mycket lättare att förstå den stora bilden av hur det fungerar med infografiken, eller hur?

Du kan göra det med vilken vetenskaplig information du vill med hjälp av Mind the Graph. Plattformen är till för att ge dig möjlighet att bättre kommunicera vetenskaplig information. Läs mer om hur du använder plattformen och kontakta oss om du behöver hjälp!

Referens

AI, T. et al. Korrelation mellan DT av bröstkorgen och RT-PCR-testning för coronavirus 2019 (covid-19) i Kina: En rapport om 1014 fall. Radiology, v. 296, n. 2, s. E32-E40, 26 fev. 2020.

GIBELLINI, D. et al. Kvantitativ detektion av human immunbristvirus typ 1 (HIV-1) virusbelastning med SYBR green real-time RT-PCR-teknik hos HIV-1 seropositiva patienter. Journal of Virological Methods, v. 115, n. 2, s. 183-189, 1 fev. 2004.

JAMES, D. Ett enkelt och tillförlitligt protokoll för detektion av apple stem grooving virus genom RT-PCR och i en multiplex PCR-assay. Journal of Virological Methods, v. 83, n. 1, s. 1-9, 1 dez. 1999.

LI, Y. et al. Stabilitetsfrågor vid RT-PCR-testning av SARS-CoV-2 för sjukhuspatienter som kliniskt diagnostiserats med COVID-19. Journal of Medical Virology, v. 92, n. 7, s. 903-908, 2020.

LIAO, C.-S. et al. RT-PCR-system i miniatyr för diagnos av RNA-baserade virus. Nucleic Acids Research, v. 33, n. 18, s. e156-e156, 1 out. 2005.

MOHAN, A. et al. Prevalens av virusinfektion påvisad med PCR och RT-PCR hos patienter med akut exacerbation av KOL: En systematisk genomgång. Respirology, v. 15, n. 3, s. 536-542, 2010.

NOLAN, T.; HANDS, R. E.; BUSTIN, S. A. Kvantifiering av mRNA med hjälp av realtids-RT-PCR. Nature Protocols, v. 1, n. 3, s. 1559-1582, förf. 2006.

Nytt coronavirus SARS-CoV-2 | Denna transmissionselektronm... | Flickr. Tillgänglig på: . Tillgång den: 23 juli 2020.

Prenumerera på vårt nyhetsbrev

Om Fabricio Pamplona