Veľkou súčasťou práce vedca je navrhovanie a vykonávanie experimentov.

Kombinácia laboratórnych techník odpovie na väčšinu otázok, ktoré vedci navrhujú, a pracovný postup pri navrhovaní nových metód závisí od vzdelania a skúseností vedca.

Obrázky buniek môžu biológom povedať veľa o tom, čo sa deje v procesoch a mechanizmoch, ktoré skúmajú.

Svetelná mikroskopia je veľmi rozšírená technika v biologických vedách.

Použitie farbív, protilátok a fluorescenčných sond umožňuje vedcom vidieť v bunkách mikroskopu obrazy toho, čo by inak bolo príliš malé na to, aby sa dalo vidieť a dokonca pochopiť.

Fluorescenčné mikroskopy a použitie fluorochrómov bolo možné v roku 19301a dnes je možné farbiť proteíny, organely a štruktúry v bunkách a tkanivách mnohými kombináciami fluorochrómov.

Fluorochrómy (alebo fluorofory) sú molekuly, ktoré po excitácii špecifickou vlnovou dĺžkou svetla vyžarujú svetlo definovanej vlnovej dĺžky, ktoré zachytia objektívy mikroskopu a premenia ho na skutočný obraz.

Kombinácia fluorescencie, šošoviek a kamier nám umožňuje snímať procesy vo vnútri buniek z mnohých rôznych pohľadov a aspektov.

Pomocou mikroskopu máme napríklad širší pohľad na plátok myšieho mozgu pri objektíve 2,5x alebo 4x a malé detaily skúmaného aktínového cytoskeletu v tej istej vzorke pri objektíve 63x.

Na tieto testy môžeme použiť protilátky alebo farbivá proti špecifickým proteínom prítomným v bunke alebo tkanive, pričom protilátka je zvyčajne vybavená fluoroforom.

Stokesov posun vysvetľuje tento jav: fluorofory strácajú vibračnú energiu vo forme vyžarovaného svetla, keď prechádzajú z excitovaného stavu späť do základného stavu. Fluorescenčné mikroskopy poskytnú svetlo na excitáciu fluoroforu a prijímajú jeho emitované svetlo. Emitované svetlo sa môže zachytiť objektívom, spracovať v CCD kamere a transformovať na digitálny obraz.

O získavaní obrazu buniek však budeme hovoriť neskôr. Teraz by sme vám mali predstaviť príklady a tipy na hlavné kroky pred získaním snímky.

Ako vyberáme a kombinujeme rôzne typy farbív a protilátok, aby sme videli a pochopili vzťahy medzi organelami a proteínmi vo vnútri buniek alebo tkanív?

Najprv musia vedci na základe svojho výskumu určiť, ktoré protilátky a farbivá použiť.

Napríklad, v tomto článkuMendonça sa snažil vyhodnotiť účinky a potenciálne riziká katiónových tuhých lipidových nanočastíc (cSLN) u potkanov. Každoročne sa vyvíja a skúma mnoho nanočastíc, ktorých cieľom je zlepšiť dodávku liekov alebo génov na liečbu mnohých ochorení. Jednou zo zaujímavých otázok v tejto štúdii bolo, či sa nanočastice dokážu dostať do mozgu prekonaním hematoencefalickej bariéry. Táto bariéra chráni náš mozog pred cirkulujúcimi toxínmi alebo patogénmi a zvyčajne nie je žiaduce, aby molekuly túto bariéru prekračovali. Ale v tomto konkrétnom prípade, Mendonça's Cieľom bolo, aby nanočastice prešli cez bariéru a dostali sa do mozgu, kde by sa v budúcnosti mohli použiť na dodávanie liekov alebo génov.

V snahe zistiť, či sú nanočastice prítomné v mozgovom parenchýme, autori použili marker endotelových buniek pre cievy s názvom RECA-1 (znázornený červenou farbou), zatiaľ čo bunkové jadrá boli farbené farbivom s názvom DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol), ktoré je modré. Môžeme tiež pozorovať malé zelené bodky pre nanočastice mimo ciev, čo znamená, že sa dostali do mozgového parenchýmu.

Pozrite si infografiku s vyobrazením nižšie.

Mind the Graph infografika ako navrhnúť panel pre imunofluorescenciu

Pochopme, čo robí protilátka proti RECA-1 (červená).

Tieto protilátky sú navrhnuté tak, aby slúžili ako špecifické sondy a sú zamerané na špecifický antigén (v našom prípade na proteín RECA-1).

Môžu byť označené fluoroforom alebo neskôr rozpoznané sekundárnou protilátkou spojenou s fluoroforom.

Preto po excitácii vzorky svetelným zdrojom, špecifický proteín, ktorý hľadáte, sa vo vašej vzorke rozpozná na základe emisie svetla špecifickej vlnovej dĺžky.

V prípade DAPI je toto farbivo protifarbivom jadier a nukleozómov a po naviazaní na AT oblasti DNA vyžaruje modrú fluorescenciu.

Ako navrhnúť panel pre imunofluorescenciu?

Začnite týmito krokmi:

  1. Kúpte si (alebo si požičajte! Veda by mala veľmi spolupracovať!) protilátky a farbivá potrebné pre váš výskum. Uprednostňujte primárne protilátky (bez sond) a z primárnej protilátky si kúpte sekundárne protilátky špecifické pre hostiteľský druh. Ak napríklad používate primárnu protilátku vyrobenú u králikov, použite sekundárnu protilátku proti králikom. To zaručí špecifickosť. 
  2. Použitie sekundárnych protilátok označených fluorofórmi zvýši váš signál tým, že sa na jednu primárnu protilátku deteguje viac antigénov. Takisto je to dynamickejší spôsob vypracovania rôznych testov, pretože umožňuje výskumníkovi modifikovať farby v paneli na základe jeho potrieb. 
  3. Ďalším dôležitým krokom je skontrolovať, aké filtre môžete v mikroskope použiť. Mali by ste sa uistiť, že excitačné a emisné vlnové dĺžky vašich fluoroforov ležia vo vnútri excitačných a emisných filtrov; inak nebudete môcť zachytiť emisné svetlo z vašich sond. Môžete použiť Prehliadač fluorescenčných spektier skontrolovať kompatibilitu.
  4. Aby ste sa uistili, že sa excitačné a emisné vlnové dĺžky všetkých vašich fluoroforov a farbív neprekrývajú v rámci tej istej analýzy, Prehliadač fluorescenčných spektier je skvelou voľbou. Pokrývajú takmer všetky dostupné fluorofory!

Nakoniec skontrolujte príklad hypotetického experimentu, v ktorom máme Hoechst 33258 pre nukleové kyseliny a primárnu protilátku proti RECA-1 označenú sekundárnou protilátkou Alexa Fluor 647.

Ideálne by bolo použiť mikroskop s kockou DAPI (excitácia 377/50 a emisia 447/60) a kockou CY5 (excitácia 628/40 a emisia 685/40). Všetky tieto informácie sme vložili na Prehliadač fluorescenčných spektier a získali sme spektrá pre obe farbivá a šírky pásma pre obe kocky (pozrite si spektrum v infografike vyššie).

Táto hypotetická esej je dobrým príkladom, kde spektrá fluoroforov patria do excitačných a emisných filtrov, čo umožňuje výskumníkovi čo najlepšie zachytiť jeho vzorky.

Teraz je čas ísť do laboratória a všetko uplatniť v praxi!

Dúfam, že vám tieto tipy pomôžu pri vašom ďalšom laboratórnom experimente. Veľa šťastia!

Odkazy:

  1. Úvod do fluorescenčnej mikroskopie. MikroskopiaU spoločnosti Nikon https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy. Prístupné 2021-04-11 17:20:40.
Súvisiace články
logo-odhláška

Prihláste sa na odber nášho newslettera

Exkluzívny vysokokvalitný obsah o efektívnom vizuálnom
komunikácia vo vede.

- Exkluzívny sprievodca
- Tipy na dizajn
- Vedecké novinky a trendy
- Návody a šablóny