Mikroskooppi: Miten tutkijat käyttävät fluoresenssia nähdäkseen solujen sisälle -

Suuri osa tiedemiehen rutiinista on kokeiden suunnittelu ja suorittaminen.

Laboratoriotekniikoiden yhdistelmä vastaa useimpiin tutkijoiden esittämiin kysymyksiin, ja uusien menetelmien ehdottaminen riippuu tutkijan taustasta ja kokemuksesta.

Biologeille solukuvat voivat kertoa paljon siitä, mitä heidän tutkimissaan prosesseissa ja mekanismeissa tapahtuu.

Valomikroskopia on hyvin yleinen tekniikka biologisissa tieteissä.

Väriaineiden, vasta-aineiden ja fluoresoivien koettimien käytön ansiosta tutkijat voivat nähdä mikroskoopin soluissa kuvia siitä, mikä muuten olisi liian pientä nähtäväksi ja jopa ymmärrettäväksi.

Fluoresenssimikroskoopit ja fluorokromien käyttö tuli mahdolliseksi vuonna 1930¹, ja nykyään on mahdollista värjätä proteiineja, organelleja sekä solujen ja kudosten rakenteita monilla fluorokromiyhdistelmillä.

Fluorokromit (tai fluorofoorit) ovat molekyylejä, jotka tietyllä valon aallonpituudella herätettäessä säteilevät tietyn aallonpituuden valoa, jonka mikroskoopin linssit vangitsevat ja muuttavat varsinaiseksi kuvaksi.

Fluoresenssin, objektiivien ja kameroiden yhdistelmä mahdollistaa kuvan ottamisen solujen sisäisistä prosesseista monista eri näkymistä ja näkökulmista.

Esimerkiksi mikroskoopin avulla voimme tarkastella hiiren aivoviipaletta laajemmin 2,5x- tai 4x-objektiivilla ja tutkia samasta näytteestä aktiinisytoskeletin pieniä yksityiskohtia 63x-objektiivilla.

Näiden määritysten mahdollistamiseksi voimme käyttää vasta-aineita tai väriaineita tiettyjä solussa tai kudoksessa olevia proteiineja vastaan, ja vasta-aineessa on yleensä fluorofori.

Stokesin siirtymä selittää tämän ilmiön: fluorofoorit menettävät värähtelyenergiaa emittoituvan valon muodossa, kun ne siirtyvät kiihdytetystä tilasta takaisin perustilaan. Fluoresenssimikroskoopit tuottavat valoa fluoroforin herättämiseksi ja vastaanottavat sen emittoiman valon. Emittoitunut valo voidaan vangita linssillä, käsitellä CCD-kamerassa ja muuntaa digitaaliseksi kuvaksi.

Mutta puhutaan solukuvien ottamisesta myöhemmin. Nyt meidän pitäisi esitellä esimerkkejä ja vinkkejä tärkeimmistä vaiheista ennen kuvan ottamista.

Miten valitsemme ja yhdistelemme erityyppisiä väriaineita ja vasta-aineita, jotta voimme nähdä ja ymmärtää solujen tai kudosten sisällä olevien organellien ja proteiinien välisiä suhteita?

Tutkijoiden on ensin määritettävä, mitä vasta-aineita ja väriaineita he käyttävät tutkimuksensa perusteella.

Esimerkiksi, tässä artikkelissa, Mendonça yritti arvioida kationisten kiinteiden lipidin nanohiukkasten (cSLN) vaikutuksia ja mahdollisia riskejä rotilla. Joka vuosi kehitetään ja tutkitaan monia nanohiukkasia, joilla pyritään tehostamaan lääkkeiden tai geenien kuljettamista monien sairauksien hoitoon. Yksi tämän tutkimuksen mielenkiintoisista kysymyksistä oli, pystyivätkö nanohiukkaset pääsemään aivoihin ylittämällä veri-aivoesteen. Tämä este suojaa aivojamme kiertäviltä myrkyiltä tai taudinaiheuttajilta, ja yleensä ei ole toivottavaa, että molekyylit ylittävät esteen. Mutta tässä erityistapauksessa Mendonçan Tavoitteena oli, että nanohiukkaset ylittäisivät esteen ja pääsisivät aivoihin, jotta ne voisivat tulevaisuudessa toimittaa lääkkeitä tai geenejä.

Halutessaan nähdä, onko nanohiukkasia läsnä aivojen parenkyymissä, kirjoittajat käyttivät verisuonten endoteelisolujen merkkiainetta RECA-1:tä (punainen väri), kun taas solujen tumat värjättiin DAPI-väriaineella (4′,6-diamidino-2-fenylindoli), joka on sininen. Voimme myös havaita pieniä vihreitä pisteitä nanohiukkasista verisuonten ulkopuolella, mikä tarkoittaa, että ne ovat päässeet aivojen parenkyymiin.

Tutustu alla olevaan infografiikkaan, jossa on esittelykuva.

Mind the Graph-infografiikka: miten suunnitella paneeli immunofluoresenssia varten?

Ymmärretään, mitä RECA-1-vasta-aine (punainen) tekee.

Nämä vasta-aineet on suunniteltu toimimaan spesifisinä koettimina, ja ne kohdistuvat tiettyyn antigeeniin (meidän tapauksessamme RECA-1-proteiiniin).

Ne voidaan merkitä fluorofoorilla tai tunnistaa myöhemmin fluorofooriin yhdistetyllä sekundäärisellä vasta-aineella.

Sen jälkeen, kun näytettä on jännitetty valonlähteellä, Etsimäsi proteiini tunnistetaan näytteessäsi valon emittoimisesta tietyllä aallonpituudella..

DAPI:n tapauksessa tämä väriaine on tuman ja nukleosomien vastaväri, ja se säteilee sinistä fluoresenssia sitoutuessaan DNA:n AT-alueisiin.

Miten suunnitella paneeli immunofluoresenssia varten?

Aloita näistä vaiheista:

Osta (tai lainaa! Tieteen pitäisi olla hyvin yhteistyökykyistä!) vasta-aineita ja väriaineita, jotka ovat välttämättömiä tutkimuksellesi. Suosi ensisijaisesti primaarivasta-aineita (ilman koettimia) ja osta primaarivasta-aineesta isäntälajille spesifisiä sekundaarivasta-aineita. Jos käytät esimerkiksi kaniinilla tuotettua primaarivasta-ainetta, käytä kaniinivasta-ainetta. Tämä takaa spesifisyyden.
Fluoroforeilla leimattujen sekundääristen vasta-aineiden käyttö parantaa signaalia, koska ne havaitsevat enemmän antigeenejä primaarista vasta-ainetta kohden. Tämä on myös dynaamisempi tapa kehittää erilaisia määrityksiä, koska tutkija voi muuttaa paneelin värejä tarpeidensa mukaan.
Toinen tärkeä vaihe on tarkistaa mikroskoopista, mitä suodattimia on käytettävissä. Varmista, että fluorofoorisi heräte- ja emissioaallonpituudet ovat heräte- ja emissiosuodattimien sisällä, sillä muuten et pysty vangitsemaan koettimien emissiovaloa. Voit käyttää Fluoresenssispektrien katseluohjelma yhteensopivuuden tarkistamiseksi.
Varmista, että kaikkien fluorofoorien ja väriaineiden heräte- ja emissioaallonpituudet eivät mene päällekkäin samassa määrityksessä, Fluoresenssispektrien katseluohjelma on loistava valinta. Ne kattavat lähes kaikki saatavilla olevat fluorofoorit!

Tarkista lopuksi esimerkki hypoteettisesta kokeesta, jossa meillä on Hoechst 33258 nukleiinihappoja varten ja ensisijainen vasta-aine RECA-1:tä vastaan, joka on merkitty toissijaisella vasta-aineella Alexa Fluor 647.

Ihannetapauksessa käytämme mikroskooppia, jossa on DAPI-kuutio (heräte 377/50 ja emissio 447/60) ja CY5-kuutio (heräte 628/40 ja emissio 685/40). Kaikki nämä tiedot asetamme osoitteeseen Fluoresenssispektrien katseluohjelma ja saimme spektrit molemmille väriaineille sekä kaistanleveydet molemmille kuutioille (katso spektri yllä olevasta infograafista).

Tämä hypoteettinen essee on hyvä esimerkki, jossa fluorofoorien spektrit kuuluvat heräte- ja emissiosuodattimien sisälle, jolloin tutkija voi tallentaa näytteensä parhaalla mahdollisella tavalla.

Nyt on aika mennä laboratorioon ja panna kaikki käytäntöön!

Toivottavasti näistä vinkeistä on apua seuraavassa laboratoriokokeessasi. Onnea matkaan!

Viitteet:

Johdatus fluoresenssimikroskopiaan. Nikonin mikroskooppiU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . Käytetty 2021-04-11 17:20:40.

Mikroskooppi: Miten tutkijat käyttävät fluoresenssia nähdäkseen solujen sisälle?

Tilaa uutiskirjeemme