Suur osa teadlase rutiinist on katsete kavandamine ja läbiviimine.

Laboritehnikate kombinatsioon annab vastuse enamikule teadlaste esitatud küsimustele ning uute meetodite väljapakkumise töövoog sõltub teadlase taustast ja kogemustest.

Bioloogide jaoks võivad rakupildid palju öelda selle kohta, mis toimub nende uuritavate protsesside ja mehhanismidega.

Valgusmikroskoopia on bioloogiateadustes väga levinud meetod.

Värvainete, antikehade ja fluorestseeruvate proovide kasutamine võimaldab teadlastel näha mikroskoobi rakkudes pilte sellest, mis muidu oleks liiga väike, et seda näha ja isegi mõista.

Fluorestsentsmikroskoobid ja fluorokroomide kasutamine sai võimalikuks 1930. aastal1ning tänapäeval on võimalik kasutada mitmeid fluorokroomide kombinatsioone valkude, organellide ja struktuuride värvimiseks rakkudes ja kudedes.

fluorokroomid (või fluorofoorid) on molekulid, mis konkreetse lainepikkusega valguse ergastamisel kiirgavad kindla lainepikkusega valgust, mida mikroskoobi läätsed püüavad ja muundavad tegelikuks pildiks.

Fluorestsentsi, objektiivide ja kaamerate kombinatsioon võimaldab meil pildistada rakkude sisemisi protsesse mitmest erinevast vaatepunktist ja aspektist.

Näiteks on meil mikroskoobi abil võimalik näha hiire aju viilu laiemalt 2,5x või 4x objektiiviga ning 63x objektiivi kasutades sama proovi aktiintsütoskeleti väikseid detaile.

Selliste analüüside tegemiseks saame kasutada antikehi või värvaineid rakus või koes olevate spetsiifiliste valkude vastu, kusjuures antikeha on tavaliselt varustatud fluorofooriga.

Stokesi nihe seletab seda nähtust: fluorofoorid kaotavad vibratsioonienergiat kiiratava valguse kujul, kui nad muutuvad ergastatud olekust tagasi põhiseisundisse. Fluorestsentsmikroskoobid annavad valguse fluorofoori ergutamiseks ja võtavad vastu selle emiteeritud valgust. Välja kiiratud valgust saab objektiiviga kinni püüda, töödelda CCD-kaameras ja muuta see digitaalseks pildiks.

Aga räägime rakupildi hankimisest hiljem. Nüüd peaksime tutvustama teile näiteid ja näpunäiteid peamiste sammude kohta enne pildi omandamist.

Kuidas me valime ja kombineerime erinevaid värvaineid ja antikehi, et näha ja mõista rakkude või kudede organellide ja valkude vahelisi seoseid?

Kõigepealt peavad teadlased kindlaks määrama, milliseid antikehi ja värvaineid nad oma uuringute põhjal kasutavad.

Näiteks, käesolevas artiklis, püüdis Mendonça hinnata katioonsete tahkete lipiidide nanoosakeste (cSLN) mõju ja võimalikke riske rottidel. Igal aastal töötatakse välja ja uuritakse palju nanoosakesi, mille eesmärk on parandada ravimite või geenide manustamist paljude haiguste raviks. Üks huvitav küsimus selles uuringus oli, kas nanoosakesed suudavad jõuda ajju, ületades vere-aju barjääri. See barjäär kaitseb meie aju tsirkuleerivate toksiinide või haigustekitajate eest ning tavaliselt ei ole soovitav, et molekulid seda barjääri ületavad. Kuid sel konkreetsel juhul, Mendonça's eesmärk oli, et nanoosakesed ületaksid barjääri ja jõuaksid ajju, et tulevikus saaks neid kasutada ravimite või geenide manustamiseks.

Soovides näha, kas nanoosakesed on olemas ajuparenšüümis, kasutasid autorid endoteelirakkude markerit RECA-1 (kujutatud punasena), samas kui rakutuuma värviti värviga DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindool), mis on sinine. Me võime täheldada ka väikeseid rohelisi punkte nanoosakeste kohta väljaspool veresooni, mis tähendab, et nad jõudsid ajuparenšüümi.

Vaadake allolevat infograafikat koos representatsioonipildiga.

Mind the Graph infograafika, kuidas kujundada immunofluorestsentsuse paneel

Mõistame, mida teeb RECA-1 antikeha (punane).

Need antikehad on mõeldud spetsiifiliste proovide jaoks ja need on suunatud spetsiifilisele antigeenile (meie puhul valk RECA-1).

Neid võib märgistada fluorofooriga või hiljem ära tunda fluorofooriga seotud sekundaarse antikeha abil.

Seega, pärast proovi ergutamist valgusallikaga, konkreetne valk, mida te otsite, tuvastatakse teie proovis valguse erilise lainepikkuse emissiooni järgi..

DAPI puhul on see värvaine tuumade ja nukleosoomide kontrastvärv ning see kiirgab sinist fluorestsentsi, kui see seondub DNA AT-piirkondadega.

Kuidas kujundada immunofluorestsentsuse paneel?

Alustage neist sammudest:

  1. Ostke (või laenake! Teadus peaks olema väga koostööaldis!) oma uurimistööks vajalikke antikehi ja värvaineid. Eelistage primaarseid antikehi (ilma proovideta) ja ostke primaarsest antikehast peremeesliigile spetsiifilisi sekundaarseid antikehi. Näiteks kui kasutate primaarset antikeha, mis on toodetud küülikutel, kasutage sekundaarset antikeha küülikuvastast antikeha. See tagab spetsiifilisuse. 
  2. Fluorofooridega märgistatud sekundaarsete antikehade kasutamine suurendab teie signaali, kuna ühe primaarse antikeha kohta on tuvastatud rohkem antigeene. Samuti on see dünaamilisem viis erinevate analüüside väljatöötamiseks, sest see võimaldab uurijal muuta paneeli värve vastavalt oma vajadustele. 
  3. Teine oluline samm on kontrollida oma mikroskoobis, milliseid filtreid on võimalik kasutada. Peaksite veenduma, et teie fluorofooride ergutus- ja emissioonilainete lainepikkused jäävad ergutus- ja emissioonifiltrite sisse; vastasel juhul ei saa te oma sondide emissioonivalgust tabada. Võite kasutada Fluorestsentsi spektri vaataja ühilduvuse kontrollimiseks.
  4. Veenduge, et kõigi teie fluorofooride ja värvainete ergutus- ja emissioonilainete lainepikkused ei kattuksid ühe ja sama analüüsi raames, Fluorestsentsi spektri vaataja on suurepärane valik. Nad katavad peaaegu kõik olemasolevad fluorofoorid!

Lõpuks vaadake näide hüpoteetilise katse kohta, kus meil on Hoechst 33258 nukleiinhapete jaoks ja esmane antikeha RECA-1 vastu, mis on märgistatud sekundaarse antikehaga Alexa Fluor 647.

Ideaalis kasutaksime mikroskoopi, millel on DAPI kuubik (ergutus 377/50 ja emissioon 447/60) ja CY5 kuubik (ergutus 628/40 ja emissioon 685/40). Kogu selle teabe sisestame aadressil Fluorestsentsi spektri vaataja ja saime mõlema värvaine spektrid ning mõlema kuubiku ribalaiused (vaadake spektrit ülalpool olevas infograafikas).

See hüpoteetiline essee on hea näide, kus fluorofooride spektrid kuuluvad ergutus- ja emissioonifiltrite sisse, mis võimaldab uurijal oma proove parimal võimalikul viisil jäädvustada.

Nüüd on aeg minna laborisse ja panna kõik praktikasse!

Loodan, et need nõuanded aitavad teid teie järgmises laborikatses. Palju õnne!

Viited:

  1. Sissejuhatus fluorestsentsmikroskoopiasse. Nikoni mikroskoopiaU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy. Kasutatud 2021-04-11 17:20:40.
Seotud artiklid
logo-subscribe

Tellige meie uudiskiri

Eksklusiivne kvaliteetne sisu tõhusa visuaalse
teabevahetus teaduses.

- Eksklusiivne juhend
- Disaini näpunäited
- Teaduslikud uudised ja suundumused
- Juhendid ja mallid