Μικροσκόπηση: Φθορισμού για να δουν μέσα στα κύτταρα -

Ένα μεγάλο μέρος της καθημερινότητας του επιστήμονα είναι να σχεδιάζει και να εκτελεί πειράματα.

Ο συνδυασμός εργαστηριακών τεχνικών θα απαντήσει στα περισσότερα από τα ερωτήματα που προτείνουν οι επιστήμονες, ενώ η ροή εργασίας για την πρόταση νέων μεθόδων εξαρτάται από το υπόβαθρο και την εμπειρία του επιστήμονα.

Για τους βιολόγους, οι εικόνες των κυττάρων μπορούν να πουν πολλά για το τι συμβαίνει με τις διαδικασίες και τους μηχανισμούς που μελετούν.

Μικροσκοπία φωτός είναι μια πολύ διαδεδομένη τεχνική στις βιολογικές επιστήμες.

Η χρήση χρωστικών ουσιών, αντισωμάτων και φθορίζοντων ανιχνευτών επιτρέπει στους επιστήμονες να βλέπουν στα κύτταρα του μικροσκοπίου εικόνες όσων διαφορετικά ήταν πολύ μικρά για να τα δουν ή και να τα κατανοήσουν.

Μικροσκόπια φθορισμού και η χρήση φθοριοχρωμάτων έγινε δυνατή το 1930¹, και σήμερα είναι δυνατοί πολλοί συνδυασμοί φθοριοχρωμάτων για τη χρώση πρωτεϊνών, οργανιδίων και δομών μέσα σε κύτταρα και ιστούς.

Φθοριοχρώματα (ή φθοριοφόρα) είναι μόρια τα οποία, όταν διεγείρονται με ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος φωτός, εκπέμπουν φως καθορισμένου μήκους κύματος το οποίο συλλαμβάνεται από τους φακούς ενός μικροσκοπίου και μετατρέπεται σε πραγματική εικόνα.

Ο συνδυασμός φθορισμού, φακών και φωτογραφικών μηχανών μας επιτρέπει να λαμβάνουμε μια εικόνα των διεργασιών στο εσωτερικό των κυττάρων από πολλές διαφορετικές απόψεις και πτυχές.

Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο, έχουμε μια ευρύτερη άποψη μιας φέτας εγκεφάλου ποντικού σε αντικειμενικό φακό 2,5x ή 4x και μικρές λεπτομέρειες του εξεταζόμενου κυτταροσκελετού ακτίνης στο ίδιο δείγμα με αντικειμενικό φακό 63x.

Για να είναι δυνατές αυτές οι δοκιμασίες, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε αντισώματα ή χρωστικές ουσίες έναντι συγκεκριμένων πρωτεϊνών που υπάρχουν στο κύτταρο ή τον ιστό, και το αντίσωμα συνήθως συνοδεύεται από φθοριόφορο.

Η μετατόπιση του Stokes εξηγεί αυτό το φαινόμενο: τα φθοριοφόρα χάνουν ενέργεια δόνησης με τη μορφή εκπεμπόμενου φωτός όταν μεταπίπτουν από μια διεγερμένη κατάσταση στη βασική κατάσταση. Τα μικροσκόπια φθορισμού παρέχουν το φως για τη διέγερση του φθοριοφόρου και λαμβάνουν το εκπεμπόμενο φως του. Το εκπεμπόμενο φως μπορεί να συλλεχθεί από έναν φακό, να υποστεί επεξεργασία στο εσωτερικό μιας κάμερας CCD και να μετατραπεί σε ψηφιακή εικόνα.

Αλλά ας μιλήσουμε για την απόκτηση εικόνων κυττάρων αργότερα. Τώρα, θα πρέπει να σας παρουσιάσουμε παραδείγματα και συμβουλές για τα κύρια βήματα πριν από την απόκτηση της εικόνας σας.

Πώς επιλέγουμε και συνδυάζουμε διαφορετικούς τύπους χρωστικών ουσιών και αντισωμάτων, για να δούμε και να κατανοήσουμε τις σχέσεις μεταξύ οργανιδίων και πρωτεϊνών στο εσωτερικό των κυττάρων ή των ιστών;

Πρώτον, οι επιστήμονες πρέπει να καθορίσουν ποια αντισώματα και χρωστικές ουσίες θα χρησιμοποιήσουν με βάση την έρευνά τους.

Για παράδειγμα, στο παρόν άρθρο, ο Mendonça προσπαθούσε να αξιολογήσει τις επιδράσεις και τους πιθανούς κινδύνους των κατιονικών νανοσωματιδίων στερεών λιπιδίων (cSLN) σε αρουραίους. Πολλά νανοσωματίδια αναπτύσσονται και μελετώνται κάθε χρόνο, με στόχο την ενίσχυση της χορήγησης φαρμάκων ή γονιδίων για τη θεραπεία πολλών ασθενειών. Ένα από τα ενδιαφέροντα ερωτήματα σε αυτή τη μελέτη ήταν εάν τα νανοσωματίδια ήταν σε θέση να φτάσουν στον εγκέφαλο διασχίζοντας τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Αυτός ο φραγμός προστατεύει τον εγκέφαλό μας από τις κυκλοφορούσες τοξίνες ή τα παθογόνα, και συνήθως, δεν είναι επιθυμητό να υπάρχουν μόρια που διασχίζουν τον φραγμό. Αλλά σε αυτή τη συγκεκριμένη περίπτωση, Mendonça's Στόχος ήταν τα νανοσωματίδια να περάσουν τον φραγμό και να φτάσουν στον εγκέφαλο, για να μεταφέρουν φάρμακα ή γονίδια σε μια μελλοντική εφαρμογή.

Θέλοντας να δουν αν τα νανοσωματίδια υπήρχαν στο εγκεφαλικό παρέγχυμα, οι συγγραφείς χρησιμοποίησαν έναν δείκτη ενδοθηλιακών κυττάρων για τα αγγεία που ονομάζεται RECA-1 (απεικονίζεται με κόκκινο χρώμα), ενώ οι πυρήνες των κυττάρων χρωματίστηκαν με μια χρωστική που ονομάζεται DAPI (4′,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη), η οποία είναι μπλε. Μπορούμε επίσης να παρατηρήσουμε μικρές πράσινες κουκκίδες για τα νανοσωματίδια έξω από τα αγγεία, πράγμα που σημαίνει ότι έφτασαν στο εγκεφαλικό παρέγχυμα.

Δείτε το παρακάτω infographic με μια εικόνα αναπαράστασης.

Mind the Graph infographic πώς να σχεδιάσετε ένα πάνελ για ανοσοφθορισμό

Ας κατανοήσουμε τι κάνει το αντίσωμα για το RECA-1 (κόκκινο).

Αυτά τα αντισώματα έχουν σχεδιαστεί για να χρησιμεύουν ως ειδικοί ανιχνευτές και στοχεύουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο (στην περίπτωσή μας, την πρωτεΐνη RECA-1).

Μπορούν να επισημανθούν με φθοριοφόρο ή να αναγνωριστούν αργότερα από ένα δευτερογενές αντίσωμα συνδεδεμένο με φθοριοφόρο.

Επομένως, μετά τη διέγερση του δείγματος με μια πηγή φωτός, η συγκεκριμένη πρωτεΐνη που αναζητάτε θα αναγνωρίζεται στο δείγμα σας από την εκπομπή φωτός σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος.

Στην περίπτωση της DAPI, η χρωστική αυτή είναι αντιχρωστική των πυρήνων και των νουκλεοσωμάτων και εκπέμπει μπλε φθορισμό όταν συνδέεται με περιοχές AT του DNA.

Πώς να σχεδιάσετε ένα πάνελ για ανοσοφθορισμό;

Ξεκινήστε με αυτά τα βήματα:

Αγοράστε (ή δανειστείτε! Η επιστήμη πρέπει να είναι πολύ συνεργατική!) αντισώματα και χρωστικές ουσίες που είναι απαραίτητες για την έρευνά σας. Προτιμήστε τα πρωτογενή αντισώματα (χωρίς ανιχνευτές) και αγοράστε δευτερογενή αντισώματα ειδικά για το είδος ξενιστή από το πρωτογενές αντίσωμα. Για παράδειγμα, εάν χρησιμοποιείτε ένα πρωτογενές αντίσωμα που παράγεται σε κουνέλια, χρησιμοποιήστε ένα δευτερογενές αντίσωμα για αντι-κουνέλι. Αυτό θα εγγυηθεί την εξειδίκευση.
Η χρήση δευτερογενών αντισωμάτων επισημασμένων με φθοριοφόρα θα ενισχύσει το σήμα σας ανιχνεύοντας περισσότερα αντιγόνα ανά πρωτογενές αντίσωμα. Επίσης, αυτός είναι ένας πιο δυναμικός τρόπος επεξεργασίας διαφορετικών δοκιμασιών, επειδή επιτρέπει στον ερευνητή να τροποποιεί τα χρώματα του πάνελ ανάλογα με τις ανάγκες του.
Ένα άλλο σημαντικό βήμα είναι να ελέγξετε στο μικροσκόπιό σας ποια φίλτρα είναι διαθέσιμα προς χρήση. Θα πρέπει να βεβαιωθείτε ότι τα μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής των φθοριοφόρων σας βρίσκονται εντός των φίλτρων διέγερσης και εκπομπής- διαφορετικά, δεν θα μπορείτε να συλλάβετε το φως εκπομπής από τους ανιχνευτές σας. Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε Πρόγραμμα προβολής φασμάτων φθορισμού για να ελέγξετε τη συμβατότητα.
Για να βεβαιωθείτε ότι τα μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής όλων των φθοριοφόρων και των χρωστικών σας δεν επικαλύπτονται στην ίδια δοκιμή, Πρόγραμμα προβολής φασμάτων φθορισμού είναι μια εξαιρετική επιλογή. Καλύπτουν σχεδόν όλα τα διαθέσιμα φθοριοφόρα!

Τέλος, ελέγξτε ένα παράδειγμα για ένα υποθετικό πείραμα όπου έχουμε Hoechst 33258 για τα νουκλεϊκά οξέα και ένα πρωτογενές αντίσωμα έναντι του RECA-1 επισημασμένο με ένα δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor 647.

Ιδανικά, θα χρησιμοποιούσαμε ένα μικροσκόπιο διαθέσιμο με κύβο DAPI (διέγερση 377/50 και εκπομπή 447/60) και κύβο CY5 (διέγερση 628/40 και εκπομπή 685/40). Όλες αυτές οι πληροφορίες εισάγονται στο Πρόγραμμα προβολής φασμάτων φθορισμού και πήραμε τα φάσματα και για τις δύο χρωστικές, καθώς και τα εύρη ζώνης και για τους δύο κύβους (δείτε το φάσμα στο παραπάνω infographic).

Αυτό το υποθετικό δοκίμιο είναι ένα καλό παράδειγμα όπου τα φάσματα των φθοριοφόρων ανήκουν μέσα στα φίλτρα διέγερσης και εκπομπής, καθιστώντας δυνατή για τον ερευνητή την καταγραφή των δειγμάτων του με τον καλύτερο δυνατό τρόπο.

Τώρα, ήρθε η ώρα να πάτε στο εργαστήριο και να τα εφαρμόσετε όλα στην πράξη!

Ελπίζω αυτές οι συμβουλές να σας βοηθήσουν στο επόμενο εργαστηριακό σας πείραμα. Καλή τύχη!

Αναφορές:

Εισαγωγή στη μικροσκοπία φθορισμού. Μικροσκοπία της NikonU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . Πρόσβαση 2021-04-11 17:20:40.

Μικροσκοπία: Πώς οι επιστήμονες χρησιμοποιούν φθορισμό για να δουν μέσα στα κύτταρα

Εγγραφείτε στο ενημερωτικό μας δελτίο