显微镜。科学家们如何利用荧光来观察细胞内部 --

科学家的日常工作的很大一部分是设计和进行实验。

实验室技术的组合将回答科学家提出的大部分问题，而提出新方法的工作流程取决于科学家的背景和经验。

对于生物学家来说，细胞图像可以说明他们正在研究的过程和机制发生了什么。

光镜检查 是生物科学中一项非常广泛的技术。

染料、抗体和荧光探针的使用使科学家能够在显微镜细胞中看到原本太小而无法看到甚至理解的东西的图像。

荧光显微镜 和使用氟染色剂在1930年成为可能¹今天，许多荧光色素的组合都可以用于染色蛋白质、细胞器和细胞和组织内的结构。

荧光色素（或荧光体） 是一种分子，当被特定波长的光激发时，会发出规定波长的光，被显微镜的镜头捕捉，并转化为实际图像。

荧光、镜头和照相机的结合使我们能够从许多不同的角度和方面对细胞内的过程进行成像。

例如，使用该显微镜，我们在2,5x或4x物镜下可以看到小鼠大脑切片的更广阔的视野，而在同一样品中使用63x物镜可以看到被探测的肌动蛋白细胞骨架的小细节。

为了实现这些检测，我们可以使用针对细胞或组织中存在的特定蛋白质的抗体或染料，而抗体通常带有荧光基团。

斯托克斯的转变解释了这一现象：当荧光体从激发态变回基态时，会以发射光的形式失去振动能量。荧光显微镜将提供激发荧光体的光，并接收其发射的光。发出的光可以被一个镜头捕获，在CCD相机内处理，并转化为数字图像。

但我们以后再谈细胞图像的获取。现在，我们应该向你介绍获取图像前的主要步骤的例子和提示。

我们如何选择和组合不同类型的染料和抗体，以观察和了解细胞或组织内细胞器和蛋白质之间的关系？

首先，科学家需要根据他们的研究确定使用哪些抗体和染料。

比如说。在这篇文章中门东萨试图评估阳离子固体脂质纳米颗粒（cSLNs）对大鼠的影响和潜在风险。每年都有许多纳米粒子被开发和研究，目的是加强药物或基因的传递，以治疗许多疾病。这项研究中一个有趣的问题是，纳米颗粒是否能够通过穿越血脑屏障到达大脑。这个屏障保护我们的大脑不受循环毒素或病原体的影响，通常情况下，让分子穿过这个屏障是不可取的。但在这种特殊情况下。门东萨的目标是让纳米粒子穿过屏障并到达大脑，在未来的应用中传递药物或基因。

作者希望看到纳米粒子是否存在于脑实质中，他们使用了一种叫做RECA-1的血管内皮细胞标记物（用红色表示），而细胞核则用一种叫做DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）的染料进行染色，该染料为蓝色。我们还可以观察到血管外的纳米粒子的小绿点，这意味着它们到达了脑实质。

请看下面的信息图，其中有一个代表图像。

让我们来了解RECA-1（红色）的抗体在做什么。

这些抗体被设计为特定的探针，它们针对特定的抗原（在我们的例子中是蛋白质RECA-1）。

它们可以用荧光体进行标记，或在之后被与荧光体相连的第二抗体识别。

因此，在用光源刺激样品后。你要寻找的特定蛋白质将通过发射特定波长的光在你的样品中被识别。.

就DAPI而言，这种染料是核子和核糖体的反染色剂，它与DNA的AT区域结合时发出蓝色荧光。

如何设计免疫荧光的面板？

从这些步骤开始。

购买（或借用！科学应该是非常合作的！）你的研究中必不可少的抗体和染料。优先选择一级抗体（不含探针），并从一级抗体中购买针对宿主物种的二级抗体。例如，如果使用在兔子身上产生的初级抗体，使用抗兔子的二级抗体。这将保证特异性。
使用用荧光团标记的二级抗体将通过检测每个一级抗体的更多抗原来增强你的信号。另外，这是一种更有活力的方式来阐述不同的检测，因为它允许研究人员根据她的需要来修改面板中的颜色。
另一个重要步骤是在你的显微镜内检查有哪些滤光片可供使用。你应该确保你的荧光体激发和发射波长位于激发和发射滤光片内；否则，你将无法捕捉到探针的发射光。你可以使用荧光光谱查看器来检查兼容性。
要确保你所有的荧光体和染料的激发和发射波长不会在同一个实验里面重叠。荧光光谱查看器是一个很好的选择。它们几乎涵盖了所有可用的荧光体!

最后，检查一个假设实验的例子，我们用Hoechst 33258表示核酸，用二级抗体Alexa Fluor 647标记的RECA-1的一级抗体。

理想情况下，我们会使用一个可提供DAPI立方体（激发377/50和发射447/60），和CY5立方体（激发628/40和发射685/40）的显微镜。所有这些信息我们都插在荧光光谱查看器并获得了两种染料的光谱，以及两种立方体的带宽（查看上面信息图中的光谱）。

这篇假设的文章是一个很好的例子，荧光体的光谱属于激发和发射滤光片内，使研究人员有可能以最佳方式捕捉他的样本。

现在，是时候去实验室将一切付诸实践了！"。

我希望这些提示对你的下一个实验有所帮助。祝您好运!

参考文献。

荧光显微镜简介。 尼康的MicroscopyU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy .2021-04-11 17:20:40访问。

显微镜。科学家们如何利用荧光来观察细胞内部

订阅我们的通讯