Microscopia: Como os cientistas usam a Fluorescência para ver o interior das células -

Uma grande parte da rotina do cientista é projetar e realizar experimentos.

A combinação de técnicas de laboratório responderá à maioria das questões propostas pelos cientistas, e o fluxo de trabalho para sugerir novos métodos depende da formação e experiência do cientista.

Para os biólogos, as imagens celulares podem dizer muito sobre o que está acontecendo com os processos e mecanismos que eles estão estudando.

Microscopia leve é uma técnica muito difundida nas ciências biológicas.

O uso de corantes, anticorpos e sondas fluorescentes permite que os cientistas vejam nas células do microscópio imagens do que de outra forma era pequeno demais para ser visto e até mesmo compreendido.

Microscópios de fluorescência e o uso de fluorocromos tornou-se possível em 1930¹e hoje muitas combinações de fluorocromos são possíveis para colorir proteínas, organelas e estruturas dentro das células e tecidos.

Fluorocromos (ou fluoróforos) são moléculas que quando excitadas com um comprimento de onda de luz específico, emitem luz de um comprimento de onda definido que será capturado pelas lentes de um microscópio, e transformado em uma imagem real.

A combinação de fluorescência, lentes e câmeras nos permite tirar uma imagem dos processos dentro das células em muitas visões e aspectos diferentes.

Por exemplo, usando o microscópio, temos uma visão mais ampla de uma fatia de cérebro de rato em uma objetiva de 2,5x ou 4x, e pequenos detalhes do citoesqueleto de ação sondado na mesma amostra usando uma objetiva de 63x.

Para possibilitar estes ensaios, podemos usar anticorpos ou corantes contra proteínas específicas presentes na célula ou tecido, e o anticorpo geralmente vem com um fluoróforo.

O deslocamento de Stokes explica este fenômeno: os fluoróforos perdem energia vibracional na forma de luz emitida quando mudam de um estado excitado para o estado de terra. Os microscópios de fluorescência fornecem a luz para excitar o fluoróforo, e recebem sua luz emitida. A luz emitida pode ser capturada por uma lente, processada dentro de uma câmera CCD, e transformada em uma imagem digital.

Mas vamos falar sobre a aquisição de imagem celular mais tarde. Agora, devemos apresentar-lhe exemplos e dicas para os principais passos antes de adquirir sua imagem.

Como escolher e combinar diferentes tipos de corantes e anticorpos, para ver e entender as relações entre organelas e proteínas dentro das células ou tecidos?

Primeiro, os cientistas precisam determinar quais anticorpos e corantes devem ser usados com base em suas pesquisas.

Por exemplo, neste artigoMendonça estava tentando avaliar os efeitos e os riscos potenciais das nanopartículas de lipídios sólidos catiônicos (cSLNs) em ratos. Muitas nanopartículas são desenvolvidas e estudadas a cada ano, com o objetivo de melhorar o fornecimento de medicamentos ou genes para tratar muitas doenças. Uma das questões interessantes neste estudo foi se as nanopartículas eram capazes de alcançar o cérebro atravessando a barreira hematoencefálica. Esta barreira protege nosso cérebro de toxinas ou patógenos circulantes e, geralmente, não é desejável que as moléculas atravessem a barreira. Mas neste caso em particular, Mendonça's O objetivo era que as nanopartículas atravessassem a barreira e alcançassem o cérebro, para entregar drogas ou genes em uma aplicação futura.

Disposto a ver se as nanopartículas estavam presentes no parênquima cerebral, os autores usaram um marcador de células endoteliais para os vasos chamado RECA-1 (representado em vermelho), enquanto os núcleos celulares foram corados com um corante chamado DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindole) que é azul. Também podemos observar pequenos pontos verdes para as nanopartículas fora dos vasos, o que significa que elas alcançaram o parênquima cerebral.

Confira o infográfico abaixo com uma imagem de representação.

Mind the Graph infográfico como projetar um painel para imunofluorescência

Vamos entender o que o anticorpo para RECA-1 (vermelho) está fazendo.

Estes anticorpos são projetados para servir como sondas específicas e visam um antígeno específico (em nosso caso, a proteína RECA-1).

Eles podem ser rotulados com um fluoróforo ou reconhecidos posteriormente por um anticorpo secundário ligado a um fluoróforo.

Portanto, depois de excitar a amostra com uma fonte de luz, a proteína específica que você está procurando será reconhecida em sua amostra pela emissão de luz em um comprimento de onda específico.

No caso do DAPI, este corante é núcleos e contra-manchas nucleósicas, e emite fluorescência azul quando ligado a regiões AT do DNA.

Como projetar um painel para imunofluorescência?

Comece com estas etapas:

Comprar (ou emprestar! A ciência deve ser muito colaborativa!) anticorpos e corantes essenciais para sua pesquisa. Dê preferência aos anticorpos primários (sem sondas), e compre anticorpos secundários específicos para a espécie hospedeira do anticorpo primário. Por exemplo, se usar um anticorpo primário produzido em coelhos, use um anticorpo secundário para anti-coelho. Isto garantirá a especificidade.
O uso de anticorpos secundários rotulados com fluoróforos melhorará seu sinal ao detectar mais antígenos por anticorpo primário. Além disso, esta é uma maneira mais dinâmica de elaborar diferentes ensaios, pois permite à pesquisadora modificar as cores no painel com base em suas necessidades.
Outro passo importante é verificar dentro de seu microscópio quais filtros estão disponíveis para uso. Você deve certificar-se de que seus comprimentos de onda de excitação e emissão de fluoróforos estejam dentro dos filtros de excitação e emissão; caso contrário, você não será capaz de capturar a luz de emissão de suas sondas. Você pode usar Visualizador de Espectros de Fluorescência para verificar a compatibilidade.
Para garantir que os comprimentos de onda de excitação e emissão de todos os seus fluoróforos e corantes não se sobreponham dentro do mesmo ensaio, Visualizador de Espectros de Fluorescência é uma grande escolha. Eles cobrem quase todos os fluoróforos disponíveis!

Finalmente, veja um exemplo de uma experiência hipotética onde temos o Hoechst 33258 para os ácidos nucléicos, e um anticorpo primário contra RECA-1 rotulado com um anticorpo secundário Alexa Fluor 647.

O ideal seria usar um microscópio disponível com um cubo DAPI (excitação 377/50 e emissão 447/60), e um cubo CY5 (excitação 628/40 e emissão 685/40). Todas estas informações inserimos em Visualizador de Espectros de Fluorescência e obteve os espectros para ambos os corantes, e as larguras de banda para ambos os cubos (verifique o espectro no infográfico acima).

Este ensaio hipotético é um bom exemplo onde os espectros dos fluoróforos pertencem dentro dos filtros de excitação e emissão, tornando possível ao pesquisador capturar suas amostras da melhor maneira possível.

Agora, é hora de ir para o laboratório e colocar tudo em prática!

Espero que estas dicas o ajudem em sua próxima experiência de laboratório. Boa sorte!

Referências:

Introdução à Microscopia de Fluorescência. Microscopia Nikon's MicroscopyU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . Acesso 2021-04-11 17:20:40.

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