Liela daļa no zinātnieka darba pienākumiem ir eksperimentu plānošana un veikšana.

Laboratorijas metožu kombinācija atbildēs uz lielāko daļu zinātnieku ierosināto jautājumu, un darba process, lai ierosinātu jaunas metodes, ir atkarīgs no zinātnieka pieredzes un pieredzes.

Biologiem šūnu attēli var daudz ko pastāstīt par to, kas notiek ar pētāmajiem procesiem un mehānismiem.

Gaismas mikroskopija ir ļoti izplatīta metode bioloģijas zinātnēs.

Krāsvielu, antivielu un fluorescējošu zondes izmantošana ļauj zinātniekiem mikroskopa šūnās redzēt attēlus, kas citādi būtu pārāk mazi, lai tos saskatītu un pat saprastu.

Fluorescences mikroskopi un fluorohromu izmantošana kļuva iespējams 1930. gadā.1, un mūsdienās ir iespējamas daudzas fluorohromu kombinācijas, lai iekrāsotu olbaltumvielas, organellas un struktūras šūnās un audos.

Fluorohromi (vai fluorofori) ir molekulas, kas, uzbudinātas ar noteikta viļņa garuma gaismu, izstaro noteikta viļņa garuma gaismu, kuru uztver mikroskopa lēcas un pārveido faktiskā attēlā.

Fluorescences, lēcu un kameru kombinācija ļauj mums iegūt šūnu iekšienē notiekošo procesu attēlus dažādos skatos un aspektos.

Piemēram, izmantojot mikroskopu, ar 2,5x vai 4x objektīvu mēs varam iegūt plašāku peles smadzeņu griezuma attēlu, bet ar 63x objektīvu - sīkas pētāmā aktīna citoskeleta detaļas tajā pašā paraugā.

Lai veiktu šos testus, mēs varam izmantot antivielas vai krāsvielas, kas vērstas pret konkrētiem olbaltumvielām, kuras atrodas šūnā vai audos, un antivielai parasti ir pievienots fluorofors.

Šo parādību izskaidro Stoksa nobīde: fluorofori zaudē vibrācijas enerģiju izstarotās gaismas veidā, kad tie no uzbudinātā stāvokļa pāriet atpakaļ pamatstāvoklī. Fluorescences mikroskopi nodrošina gaismu fluorofora uzbudināšanai un saņem tā izstaroto gaismu. Izstaroto gaismu var uztvert ar objektīvu, apstrādāt CCD kamerā un pārveidot digitālā attēlā.

Bet par šūnu attēlu iegūšanu runāsim vēlāk. Tagad iepazīstināsim jūs ar piemēriem un padomiem par galvenajiem soļiem pirms attēla iegūšanas.

Kā mēs izvēlamies un kombinējam dažādu veidu krāsvielas un antivielas, lai redzētu un izprastu attiecības starp organelēm un olbaltumvielām šūnās vai audos?

Vispirms zinātniekiem ir jānosaka, kuras antivielas un krāsvielas izmantot, pamatojoties uz veiktajiem pētījumiem.

Piemēram, šajā rakstāMendonca centās novērtēt katjonu cieto lipīdu nanodaļiņu (cSLN) ietekmi un iespējamo risku žurkām. Katru gadu tiek izstrādātas un pētītas daudzas nanodaļiņas, kuru mērķis ir uzlabot zāļu vai gēnu piegādi daudzu slimību ārstēšanai. Viens no interesantajiem jautājumiem šajā pētījumā bija, vai nanodaļiņas spēj sasniegt smadzenes, šķērsojot hematoencefalisko barjeru. Šī barjera aizsargā mūsu smadzenes no cirkulējošiem toksīniem vai patogēniem, un parasti nav vēlams, lai molekulas šķērsotu šo barjeru. Bet šajā konkrētajā gadījumā, Mendonça's mērķis bija panākt, lai nanodaļiņas šķērsotu barjeru un nonāktu smadzenēs, lai nākotnē varētu piegādāt zāles vai gēnus.

Vēloties pārliecināties, vai nanodaļiņas atrodas smadzeņu parenhīmā, autori izmantoja endotēlija šūnu marķieri, ko sauc par RECA-1 (attēlots sarkanā krāsā), bet šūnu kodolus iekrāsoja ar krāsvielu DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindols), kas ir zila. Var novērot arī nelielus zaļus punktiņus, kas norāda uz nanodaļiņām ārpus asinsvadiem, kas nozīmē, ka tās ir sasniegušas smadzeņu parenhīmu.

Aplūkojiet zemāk redzamo infografiku ar attēlojumu.

Mind the Graph infografika par to, kā izveidot imunofluorescences paneli

Sapratīsim, ko dara RECA-1 antiviela (sarkanā krāsā).

Šīs antivielas ir izstrādātas kā specifiskas zondes, un tās ir vērstas pret konkrētu antigēnu (mūsu gadījumā - proteīnu RECA-1).

Tos var marķēt ar fluoroforu vai vēlāk atpazīt ar sekundāro antivielu, kas saistīta ar fluoroforu.

Tāpēc pēc parauga uzbudināšanas ar gaismas avotu, konkrētais proteīns, ko meklējat, paraugā tiks atpazīts pēc gaismas emisijas konkrētā viļņa garumā..

DAPI gadījumā šī krāsviela ir kodolu un nukleosomu pretkrāsa, un, saistoties ar DNS AT apgabaliem, tā izstaro zilu fluorescenci.

Kā izveidot imunofluorescences paneli?

Sāciet ar šiem soļiem:

  1. Iegādājieties (vai aizņemieties! Zinātnei ir ļoti labi jāsadarbojas!) antivielas un krāsvielas, kas nepieciešamas jūsu pētījumam. Priekšroku dodiet primārajām antivielām (bez zondēm) un iegādājieties sekundārās antivielas, kas ir specifiskas saimnieka sugai no primārās antivielas. Piemēram, ja izmantojat primāro antivielu, kas ražota trušiem, izmantojiet sekundāro antivielu pret trušiem. Tas garantēs specifiskumu. 
  2. Izmantojot sekundārās antivielas, kas marķētas ar fluoroforiem, pastiprināsiet signālu, jo uz vienu primāro antivielu tiks konstatēts vairāk antigēnu. Tas ir arī dinamiskāks veids, kā izstrādāt dažādus testus, jo ļauj pētniekam mainīt paneļa krāsas, pamatojoties uz savām vajadzībām. 
  3. Vēl viens svarīgs solis ir pārbaudīt, kādi filtri ir pieejami mikroskopā. Pārliecinieties, ka jūsu fluoroforu uzbudinājuma un emisijas viļņu garumi atrodas uzbudinājuma un emisijas filtru iekšpusē; pretējā gadījumā jūs nevarēsiet uztvert savu zondes emisijas gaismu. Jūs varat izmantot Fluorescences spektru pārlūks lai pārbaudītu saderību.
  4. Lai pārliecinātos, ka visu jūsu fluoroforu un krāsvielu uzbudinājuma un emisijas viļņu garumi nepārklājas vienā testā, Fluorescences spektru pārlūks ir lieliska izvēle. Tie aptver gandrīz visus pieejamos fluoroforus!

Visbeidzot, pārbaudiet hipotētiska eksperimenta piemēru, kurā nukleīnskābēm ir Hoechst 33258 un primārā antiviela pret RECA-1, kas marķēta ar sekundāro antivielu Alexa Fluor 647.

Vislabāk būtu izmantot mikroskopu, kas aprīkots ar DAPI kubu (uzbudinājums 377/50 un emisija 447/60) un CY5 kubu (uzbudinājums 628/40 un emisija 685/40). Visu šo informāciju mēs ievietojām Fluorescences spektru pārlūks un ieguva abu krāsvielu spektrus un joslas platumu abiem kubiem (apskatiet spektru infografikā iepriekš).

Šī hipotētiskā eseja ir labs piemērs, kur fluoroforu spektri ietilpst uzbudinājuma un emisijas filtru iekšpusē, ļaujot pētniekam iegūt paraugus vislabākajā iespējamajā veidā.

Tagad ir pienācis laiks doties uz laboratoriju un visu īstenot praksē!

Es ceru, ka šie padomi palīdzēs jums nākamajā laboratorijas eksperimentā. Veiksmi!

Atsauces:

  1. Ievads fluorescences mikroskopijā. Nikon's MicroscopyU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy. Piekļuve 2021-04-11 17:20:40.
Saistītie raksti
logotipa abonements

Abonēt mūsu biļetenu

Ekskluzīvs augstas kvalitātes saturs par efektīvu vizuālo
komunikācija zinātnē.

- Ekskluzīvs ceļvedis
- Dizaina padomi
- Zinātnes jaunumi un tendences
- Mācību pamācības un veidnes