현미경: 과학자들이 형광을 사용하여 세포 내부를 보는 방법

과학자의 일과에서 가장 큰 부분은 실험을 설계하고 수행하는 것입니다.

실험실 기술의 조합은 과학자가 제안한 대부분의 질문에 대한 답을 제공하며, 새로운 방법을 제안하는 워크플로는 과학자의 배경과 경험에 따라 달라집니다.

생물학자에게 세포 이미지는 연구 중인 과정과 메커니즘에 대해 많은 것을 알려줄 수 있습니다.

광학 현미경 는 생물 과학 분야에서 매우 널리 사용되는 기술입니다.

과학자들은 염료, 항체, 형광 프로브를 사용하여 너무 작아서 볼 수도 없고 이해할 수도 없었던 세포의 이미지를 현미경으로 볼 수 있습니다.

형광 현미경 형광등 사용 1930년에 가능해졌습니다.¹오늘날에는 세포와 조직 내의 단백질, 소기관 및 구조를 염색하기 위해 다양한 형광 염료 조합을 사용할 수 있습니다.

형광등(또는 형광체) 는 특정 파장의 빛으로 여기되면 현미경의 렌즈에 포착되어 실제 이미지로 변환되는 정해진 파장의 빛을 방출하는 분자입니다.

형광, 렌즈, 카메라의 조합을 통해 세포 내부의 프로세스를 다양한 관점과 측면에서 이미지로 촬영할 수 있습니다.

예를 들어 현미경을 사용하면 2,5배 또는 4배 대물렌즈로 마우스 뇌 슬라이스를 더 넓게 볼 수 있고, 63배 대물렌즈를 사용하면 같은 샘플에서 프로브된 액틴 세포골격의 작은 디테일을 볼 수 있습니다.

이러한 분석을 가능하게 하기 위해 세포나 조직에 존재하는 특정 단백질에 대한 항체나 염료를 사용할 수 있으며, 항체에는 일반적으로 형광물질이 함께 제공됩니다.

스토크스의 이동은 이 현상을 설명합니다. 형광체는 여기 상태에서 기저 상태로 바뀔 때 방출된 빛의 형태로 진동 에너지를 잃습니다. 형광 현미경은 형광체를 여기시키는 빛을 제공하고 방출된 빛을 수신합니다. 방출된 빛은 렌즈로 포착되어 CCD 카메라 내부에서 처리된 후 디지털 이미지로 변환될 수 있습니다.

하지만 세포 이미지 획득에 대해서는 나중에 이야기하겠습니다. 이제 이미지를 얻기 전 주요 단계에 대한 예시와 팁을 소개하겠습니다.

세포나 조직 내부의 소기관과 단백질 간의 관계를 보고 이해하기 위해 다양한 유형의 염료와 항체를 어떻게 선택하고 조합할까요?

먼저 과학자들은 연구 결과를 바탕으로 어떤 항체와 염료를 사용할지 결정해야 합니다.

예를 들어 이 문서에서멘돈사는 쥐를 대상으로 양이온성 고체 지질 나노입자(cSLN)의 효과와 잠재적 위험성을 평가하려고 했습니다. 많은 질병을 치료하기 위해 약물이나 유전자의 전달을 향상시키는 것을 목표로 매년 많은 나노 입자가 개발되고 연구되고 있습니다. 이 연구에서 흥미로운 질문 중 하나는 나노 입자가 혈액-뇌 장벽을 통과하여 뇌에 도달할 수 있는지 여부였습니다. 이 장벽은 순환하는 독소나 병원균으로부터 뇌를 보호하며, 일반적으로 분자가 장벽을 통과하는 것은 바람직하지 않습니다. 하지만 이 특별한 경우에는 그렇지 않습니다, 멘돈사 의 목표는 나노 입자가 장벽을 통과하여 뇌에 도달하여 향후 응용 분야에서 약물이나 유전자를 전달하는 것이었습니다.

연구진은 나노 입자가 뇌 실질에 존재하는지 확인하기 위해 RECA-1(빨간색으로 표시)이라는 혈관 내피 세포 마커를 사용했고, 세포 핵은 파란색인 DAPI(4′,6-디아미디노-2-페닐인돌)라는 염료로 염색했습니다. 또한 혈관 외부에 작은 녹색 점이 관찰되는데, 이는 나노 입자가 뇌실질에 도달했음을 의미합니다.

아래 인포그래픽에서 표현 이미지와 함께 확인하세요.

RECA-1(빨간색)에 대한 항체가 어떤 역할을 하는지 이해해 봅시다.

이러한 항체는 특정 프로브 역할을 하도록 설계되었으며, 특정 항원(이 경우 단백질 RECA-1)을 표적으로 합니다.

형광물질로 라벨을 붙이거나 형광물질에 연결된 2차 항체로 나중에 인식할 수 있습니다.

따라서 광원으로 샘플을 여기시킨 후, 찾고 있는 특정 단백질은 특정 파장의 빛 방출을 통해 샘플에서 인식됩니다..

DAPI의 경우, 이 염료는 핵 및 뉴클레오솜 카운터 스테인으로 DNA의 AT 영역에 결합할 때 파란색 형광을 발산합니다.

면역 형광을 위한 패널을 디자인하는 방법은?

다음 단계부터 시작하세요:

연구에 필수적인 항체와 염료를 구입(또는 빌리세요! 과학은 매우 협력적이어야 합니다!)하세요. 프로브가 없는 1차 항체를 우선적으로 사용하고, 1차 항체에서 숙주 종에 특이적인 2차 항체를 구입하세요. 예를 들어 토끼에서 생산된 1차 항체를 사용하는 경우, 항토끼용 2차 항체를 사용하세요. 이렇게 하면 특이성이 보장됩니다.
형광물질로 표지된 2차 항체를 사용하면 1차 항체당 더 많은 항원을 검출하여 신호를 향상시킬 수 있습니다. 또한 연구자가 필요에 따라 패널의 색상을 수정할 수 있기 때문에 다양한 분석을 보다 동적으로 정교하게 수행할 수 있습니다.
또 다른 중요한 단계는 현미경 내에서 어떤 필터를 사용할 수 있는지 확인하는 것입니다. 형광체 여기 및 방출 파장이 여기 및 방출 필터 내부에 있는지 확인해야 합니다. 그렇지 않으면 프로브에서 방출광을 캡처할 수 없습니다. 다음을 사용할 수 있습니다. 형광 스펙트럼 뷰어 를 클릭하여 호환성을 확인하세요.
모든 형광체와 염료의 여기 및 방출 파장이 동일한 분석 내에서 겹치지 않는지 확인합니다, 형광 스펙트럼 뷰어 는 훌륭한 선택입니다. 사용 가능한 거의 모든 형광체를 커버합니다!

마지막으로, 핵산에 Hoechst 33258을 사용하고 RECA-1에 대한 1차 항체에 2차 항체 Alexa Fluor 647을 표지하는 가상 실험의 예를 확인합니다.

이상적으로는 DAPI 큐브(여기 377/50 및 방출 447/60)와 CY5 큐브(여기 628/40 및 방출 685/40)가 있는 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 이 모든 정보는 형광 스펙트럼 뷰어 를 사용하여 두 염료의 스펙트럼과 두 큐브의 대역폭을 얻었습니다(위의 인포그래픽에서 스펙트럼을 확인하세요).

이 가상 에세이는 형광체의 스펙트럼이 여기 및 방출 필터 내부에 속해 있어 연구자가 가능한 최상의 방법으로 샘플을 캡처할 수 있는 좋은 예입니다.

이제 실험실로 가서 모든 것을 실행에 옮길 차례입니다!

이 팁이 다음 실험실 실험에 도움이 되길 바랍니다. 행운을 빕니다!

참조:

형광 현미경 소개. 니콘의 현미경U https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . 2021-04-11 17:20:40에 액세스했습니다.

현미경: 과학자들이 형광을 사용하여 세포 내부를 보는 방법

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