Mikroskopi: Bagaimana Ilmuwan Menggunakan Fluoresensi Untuk Melihat Bagian Dalam Sel -

Sebagian besar rutinitas ilmuwan adalah merancang dan melakukan eksperimen.

Kombinasi teknik laboratorium akan menjawab sebagian besar pertanyaan yang diajukan oleh para ilmuwan, dan alur kerja untuk menyarankan metode baru tergantung pada latar belakang dan pengalaman ilmuwan.

Bagi para ahli biologi, gambar sel dapat menjelaskan banyak hal tentang apa yang terjadi dengan proses dan mekanisme yang mereka pelajari.

Mikroskop cahaya adalah teknik yang sangat luas dalam ilmu biologi.

Penggunaan pewarna, antibodi, dan probe fluoresen memungkinkan para ilmuwan untuk melihat gambar sel dalam mikroskop, yang tadinya terlalu kecil untuk dilihat dan bahkan dipahami.

Mikroskop fluoresensi dan penggunaan fluorokrom menjadi mungkin pada tahun 1930¹dan saat ini banyak kombinasi fluorokrom yang memungkinkan untuk menodai protein, organel, dan struktur di dalam sel dan jaringan.

Fluorokrom (atau fluorofor) adalah molekul yang apabila dieksitasi dengan panjang gelombang cahaya tertentu, akan memancarkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu yang akan ditangkap oleh lensa mikroskop, dan ditransformasikan ke dalam gambar yang sesungguhnya.

Kombinasi fluoresensi, lensa, dan kamera memungkinkan kita untuk mengambil gambar proses di dalam sel dalam berbagai tampilan dan aspek.

Sebagai contoh, dengan menggunakan mikroskop, kami memiliki pandangan yang lebih luas dari irisan otak tikus dalam objektif 2,5x atau 4x, dan detail kecil dari sitoskeleton aktin yang diselidiki dalam sampel yang sama dengan menggunakan objektif 63x.

Untuk memungkinkan pengujian ini, kita dapat menggunakan antibodi atau pewarna terhadap protein spesifik yang ada di dalam sel atau jaringan, dan antibodi biasanya dilengkapi dengan fluorofor.

Pergeseran Stokes menjelaskan fenomena ini: fluorofor kehilangan energi getaran dalam bentuk cahaya yang dipancarkan ketika berubah dari keadaan tereksitasi kembali ke keadaan dasar. Mikroskop fluoresensi akan menyediakan cahaya untuk menggairahkan fluorofor, dan menerima cahaya yang dipancarkan. Cahaya yang dipancarkan dapat ditangkap oleh lensa, diproses di dalam kamera CCD, dan diubah menjadi gambar digital.

Tetapi, mari kita bicarakan tentang akuisisi gambar sel nanti. Sekarang, kami akan memperkenalkan kepada Anda contoh dan saran untuk langkah-langkah utama sebelum memperoleh gambar Anda.

Bagaimana kita memilih dan menggabungkan berbagai jenis pewarna dan antibodi, untuk melihat dan memahami hubungan antara organel dan protein di dalam sel atau jaringan?

Pertama, para ilmuwan perlu menentukan antibodi dan pewarna mana yang akan digunakan berdasarkan penelitian mereka.

Sebagai contoh, dalam artikel iniMendonça mencoba mengevaluasi efek dan potensi risiko nanopartikel lipid padat kationik (cSLN) pada tikus. Banyak nanopartikel yang dikembangkan dan dipelajari setiap tahun, yang bertujuan untuk meningkatkan pengiriman obat atau gen untuk mengobati banyak penyakit. Salah satu pertanyaan menarik dalam penelitian ini adalah apakah nanopartikel dapat mencapai otak dengan melintasi sawar darah-otak. Penghalang ini melindungi otak kita dari racun atau patogen yang bersirkulasi, dan biasanya, tidak diinginkan adanya molekul yang melintasi penghalang tersebut. Namun dalam kasus khusus ini, Mendonça's Tujuannya adalah agar nanopartikel dapat melewati penghalang dan mencapai otak, untuk mengantarkan obat atau gen dalam aplikasi di masa depan.

Ingin melihat apakah nanopartikel hadir di parenkim otak, para penulis menggunakan penanda sel endotel untuk pembuluh darah yang disebut RECA-1 (diwakili dalam warna merah), sementara inti sel diwarnai dengan pewarna yang disebut DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenilindol) yang berwarna biru. Kita juga dapat mengamati titik-titik hijau kecil untuk nanopartikel di luar pembuluh darah, yang berarti mereka mencapai parenkim otak.

Lihat infografik di bawah ini dengan gambar representasi.

Infografik Mind the Graph cara mendesain panel untuk imunofluoresensi

Mari kita pahami apa yang dilakukan oleh antibodi untuk RECA-1 (merah).

Antibodi ini dirancang untuk berfungsi sebagai probe spesifik, dan mereka menargetkan antigen tertentu (dalam kasus kami, protein RECA-1).

Mereka dapat diberi label dengan fluorofor atau dikenali kemudian oleh antibodi sekunder yang terkait dengan fluorofor.

Oleh karena itu, setelah menggairahkan sampel dengan sumber cahaya, protein spesifik yang Anda cari akan dikenali dalam sampel Anda dengan emisi cahaya dalam panjang gelombang tertentu.

Dalam kasus DAPI, pewarna ini adalah nukleus dan nukleosom counterstain, dan memancarkan fluoresensi biru ketika berikatan dengan daerah AT DNA.

Bagaimana cara mendesain panel untuk imunofluoresensi?

Mulailah dengan langkah-langkah ini:

Beli (atau pinjam! Ilmu pengetahuan seharusnya sangat kolaboratif!) antibodi dan pewarna yang penting untuk penelitian Anda. Berikan preferensi pada antibodi primer (tanpa probe), dan belilah antibodi sekunder yang spesifik untuk spesies inang dari antibodi primer. Misalnya, jika menggunakan antibodi primer yang diproduksi pada kelinci, gunakan antibodi sekunder untuk anti-kelinci. Hal ini akan menjamin spesifisitas.
Menggunakan antibodi sekunder berlabel fluorofor akan meningkatkan sinyal Anda dengan mendeteksi lebih banyak antigen per antibodi primer. Selain itu, ini adalah cara yang lebih dinamis untuk menguraikan pengujian yang berbeda, karena memungkinkan peneliti untuk memodifikasi warna pada panel berdasarkan kebutuhannya.
Langkah penting lainnya adalah memeriksa di dalam mikroskop Anda, filter apa saja yang tersedia untuk digunakan. Anda harus memastikan bahwa panjang gelombang eksitasi dan emisi fluorofor Anda berada di dalam filter eksitasi dan emisi; jika tidak, Anda tidak akan dapat menangkap cahaya emisi dari probe Anda. Anda dapat menggunakan Penampil Spektrum Fluoresensi untuk memeriksa kompatibilitas.
Untuk memastikan bahwa panjang gelombang eksitasi dan emisi semua fluorofor dan pewarna Anda tidak tumpang tindih di dalam pengujian yang sama, Penampil Spektrum Fluoresensi adalah pilihan yang tepat. Mereka mencakup hampir semua fluorofor yang tersedia!

Terakhir, periksa contoh untuk percobaan hipotetis di mana kita memiliki Hoechst 33258 untuk asam nukleat, dan antibodi primer terhadap RECA-1 yang dilabeli dengan antibodi sekunder Alexa Fluor 647.

Idealnya, kami akan menggunakan mikroskop yang tersedia dengan kubus DAPI (eksitasi 377/50 dan emisi 447/60), dan kubus CY5 (eksitasi 628/40 dan emisi 685/40). Semua informasi ini kami sisipkan di Penampil Spektrum Fluoresensi dan memperoleh spektrum untuk kedua pewarna, dan bandwidth untuk kedua kubus (lihat spektrum pada infografik di atas).

Esai hipotetis ini adalah contoh yang bagus, di mana spektrum fluorofor berada di dalam filter eksitasi dan emisi, sehingga memungkinkan peneliti untuk menangkap sampelnya dengan cara yang terbaik.

Sekarang, saatnya pergi ke laboratorium dan mempraktikkan semuanya!

Saya harap tips ini dapat membantu Anda dalam percobaan laboratorium Anda berikutnya. Semoga berhasil!

Referensi:

Pengantar Mikroskopi Fluoresensi. Mikroskopi Nikon's MicroscopyU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . Diakses pada 2021-04-11 17:20:40.

Mikroskopi: Bagaimana Ilmuwan Menggunakan Fluoresensi Untuk Melihat Bagian Dalam Sel

Berlangganan buletin kami