A tudósok rutinjának nagy része a kísérletek megtervezése és elvégzése.

A laboratóriumi technikák kombinációja a tudósok által javasolt kérdések többségére választ ad, és az új módszereket javasló munkafolyamat a tudós hátterétől és tapasztalatától függ.

A biológusok számára a sejtek képei sokat elárulnak arról, hogy mi történik az általuk vizsgált folyamatokkal és mechanizmusokkal.

Fénymikroszkópia a biológiai tudományokban igen elterjedt technika.

A festékek, antitestek és fluoreszcens szondák használata lehetővé teszi a tudósok számára, hogy a mikroszkópos sejtekben olyan képeket lássanak, amelyek egyébként túl kicsik ahhoz, hogy láthatóak, sőt felfoghatóak legyenek.

Fluoreszcens mikroszkópok és a fluorokrómok használata 1930-ban vált lehetővé1, és ma már a fluorokrómok számos kombinációja lehetséges a fehérjék, organellumok és a sejteken és szöveteken belüli struktúrák festésére.

Fluorokrómok (vagy fluoroforok) olyan molekulák, amelyek egy meghatározott hullámhosszúságú fénnyel gerjesztve meghatározott hullámhosszúságú fényt bocsátanak ki, amelyet a mikroszkóp lencséi befognak, és tényleges képpé alakítanak.

A fluoreszcencia, a lencsék és a kamerák kombinációja lehetővé teszi, hogy a sejtekben zajló folyamatokról számos különböző nézetben és aspektusból képet készítsünk.

A mikroszkóp segítségével például 2,5x vagy 4x objektívvel szélesebb képet kaphatunk egy egér agyszeletről, 63x objektívvel pedig ugyanabban a mintában a vizsgált aktin citoszkeleton apró részleteiről.

E vizsgálatok elvégzéséhez a sejtben vagy szövetben jelen lévő specifikus fehérjékkel szemben antitesteket vagy festékeket használhatunk, és az antitest általában fluorofórral van ellátva.

A Stokes-féle eltolódás magyarázza ezt a jelenséget: a fluorofórok rezgési energiát veszítenek a kibocsátott fény formájában, amikor a gerjesztett állapotból visszaváltoznak az alapállapotba. A fluoreszcens mikroszkópok biztosítják a fluorofór gerjesztéséhez szükséges fényt, és fogadják a kibocsátott fényt. A kibocsátott fényt egy lencsével rögzíthetjük, egy CCD-kamerában feldolgozhatjuk, és digitális képpé alakíthatjuk.

De a cellaképek felvételéről majd később beszélünk. Most a képfelvételt megelőző főbb lépésekhez kell példákat és tippeket bemutatnunk.

Hogyan válasszuk ki és kombináljuk a különböző típusú festékeket és antitesteket, hogy lássuk és megértsük a sejteken vagy szöveteken belüli szervsejtek és fehérjék közötti kapcsolatokat?

Először is a tudósoknak meg kell határozniuk, hogy a kutatásaik alapján milyen antitesteket és festékeket használjanak.

Például, ebben a cikkben, Mendonça a kationos szilárd lipid nanorészecskék (cSLN) hatásait és lehetséges kockázatait próbálta felmérni patkányokon. Évente számos nanorészecskét fejlesztenek ki és tanulmányoznak, amelyek célja a gyógyszerek vagy gének szállítása számos betegség kezelésére. A vizsgálat egyik érdekes kérdése az volt, hogy a nanorészecskék képesek-e a vér-agy gáton áthatolva eljutni az agyba. Ez a gát védi agyunkat a keringő méreganyagoktól vagy kórokozóktól, és általában nem kívánatos, hogy a molekulák átlépjék a gátat. De ebben a különleges esetben, Mendonça A cél az volt, hogy a nanorészecskék átjussanak a gáton, és eljussanak az agyba, hogy egy későbbi alkalmazás során gyógyszereket vagy géneket juttassanak be.

Meg akarták nézni, hogy a nanorészecskék jelen vannak-e az agyparenchimában, ezért a szerzők az ereket jelölő RECA-1 nevű endotélsejt-markert használták (piros színnel ábrázolva), míg a sejtmagokat a DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) nevű festékkel festették meg, amely kék színű. Az ereken kívül kis zöld pöttyöket is megfigyelhetünk a nanorészecskékre, ami azt jelenti, hogy elérték az agyi parenchimát.

Tekintse meg az alábbi infografikát egy reprezentációs képpel.

Mind the Graph infografika: hogyan tervezzünk panelt immunfluoreszcenciához?

Értsük meg, mit csinál a RECA-1 antitest (piros).

Ezeket az antitesteket úgy tervezték, hogy specifikus szondaként szolgáljanak, és egy adott antigént (esetünkben a RECA-1 fehérjét) célozzák meg.

Ezeket fluorofórral lehet jelölni, vagy később egy fluorofórhoz kötött másodlagos ellenanyaggal lehet felismerni.

Ezért a minta fényforrással történő gerjesztése után, a keresett fehérje a mintában egy adott hullámhosszúságú fény kibocsátása alapján lesz felismerhető..

A DAPI esetében ez a festék a sejtmagok és nukleoszómák ellenfestéke, és a DNS AT régióihoz kötődve kék fluoreszcenciát bocsát ki.

Hogyan tervezzünk panelt immunfluoreszcenciához?

Kezdje a következő lépésekkel:

  1. Vásároljon (vagy kölcsönözzön! A tudománynak nagyon együttműködőnek kell lennie!) a kutatásához szükséges antitesteket és festékeket. Részesítse előnyben az elsődleges antitesteket (szondák nélkül), és vásároljon az elsődleges antitestből a gazdafajra specifikus másodlagos antitesteket. Például, ha nyulakban előállított primer ellenanyagot használ, használjon nyúl ellenes másodlagos ellenanyagot. Ez garantálja a specificitást. 
  2. A fluorofórral jelölt másodlagos antitestek használata fokozza a jelet azáltal, hogy több antigént detektál egy elsődleges antitestre. Emellett ez egy dinamikusabb módja a különböző próbák kidolgozásának, mivel lehetővé teszi a kutató számára, hogy igényei alapján módosítsa a panel színeit. 
  3. Egy másik fontos lépés, hogy ellenőrizze a mikroszkópon belül, milyen szűrők állnak rendelkezésre. Meg kell győződnie arról, hogy a fluorofór gerjesztési és emissziós hullámhossza a gerjesztési és emissziós szűrőkön belül van; ellenkező esetben nem fogja tudni rögzíteni a szondák emissziós fényét. Használhat Fluoreszcencia spektrum megtekintő a kompatibilitás ellenőrzéséhez.
  4. Annak biztosítása érdekében, hogy az összes fluorofór és színezék gerjesztési és emissziós hullámhossza ne fedje egymást ugyanazon vizsgálaton belül, Fluoreszcencia spektrum megtekintő nagyszerű választás. Szinte az összes elérhető fluorofórt lefedik!

Végül nézzen meg egy példát egy hipotetikus kísérletre, ahol a nukleinsavakhoz Hoechst 33258, a RECA-1 elleni elsődleges ellenanyagot pedig Alexa Fluor 647-es másodlagos ellenanyaggal jelöltük.

Ideális esetben olyan mikroszkópot használnánk, amely DAPI kockával (gerjesztés 377/50 és emisszió 447/60) és CY5 kockával (gerjesztés 628/40 és emisszió 685/40) áll rendelkezésre. Mindezeket az információkat beillesztettük a Fluoreszcencia spektrum megtekintő és megkaptuk mindkét színezék spektrumát, valamint mindkét kocka sávszélességét (nézze meg a spektrumot a fenti infografikán).

Ez a hipotetikus esszé jó példa arra, hogy a fluorofórok spektrumai a gerjesztési és emissziós szűrőkön belülre tartoznak, lehetővé téve a kutató számára, hogy a lehető legjobb módon rögzítse a mintáit.

Most itt az ideje, hogy a laborba menj, és mindent a gyakorlatba ültess!

Remélem, ezek a tippek segítenek a következő laboratóriumi kísérletedben. Sok sikert!

Hivatkozások:

  1. Bevezetés a fluoreszcens mikroszkópiába. Nikon mikroszkópiaU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy. Hozzáférés 2021-04-11 17:20:40.
Kapcsolódó cikkek
logo-subscribe

Iratkozzon fel hírlevelünkre

Exkluzív, kiváló minőségű tartalom a hatékony vizuális
kommunikáció a tudományban.

- Exkluzív útmutató
- Tervezési tippek
- Tudományos hírek és trendek
- Oktatóanyagok és sablonok