Microscopie : Comment les scientifiques utilisent la fluorescence pour voir à l'intérieur des cellules.

Une grande partie de la routine du scientifique consiste à concevoir et à réaliser des expériences.

La combinaison des techniques de laboratoire répondra à la plupart des questions proposées par les scientifiques, et la capacité à suggérer de nouvelles méthodes dépend de la formation et de l'expérience du scientifique.

Pour les biologistes, les images de cellules peuvent en dire long sur les processus et mécanismes qu'ils étudient.

Microscopie optique est une technique très répandue dans les sciences biologiques.

L'utilisation de colorants, d'anticorps et de sondes fluorescentes permet aux scientifiques de voir dans les cellules du microscope des images de ce qui était autrement trop petit pour être vu et même compris.

Microscopes à fluorescence et l'utilisation de fluorochromes est devenu possible en 1930¹Aujourd'hui, de nombreuses combinaisons de fluorochromes sont possibles pour colorer les protéines, les organites et les structures des cellules et des tissus.

Fluorochromes (ou fluorophores) sont des molécules qui, lorsqu'elles sont excitées par une longueur d'onde spécifique, émettent une lumière d'une longueur d'onde définie qui sera captée par les lentilles d'un microscope et transformée en une image réelle.

La combinaison de la fluorescence, des lentilles et des caméras nous permet de prendre une image des processus à l'intérieur des cellules sous de nombreux angles et aspects différents.

Par exemple, en utilisant le microscope, nous avons une vue plus large d'une tranche de cerveau de souris avec un objectif 2,5x ou 4x, et de petits détails du cytosquelette d'actine sondé dans le même échantillon avec un objectif 63x.

Pour permettre ces analyses, nous pouvons utiliser des anticorps ou des colorants contre des protéines spécifiques présentes dans la cellule ou le tissu, et l'anticorps est généralement accompagné d'un fluorophore.

Le déplacement de Stokes explique ce phénomène : les fluorophores perdent de l'énergie vibratoire sous forme de lumière émise lorsqu'ils passent d'un état excité à l'état fondamental. Les microscopes à fluorescence fournissent la lumière pour exciter le fluorophore et reçoivent la lumière émise. La lumière émise peut être capturée par une lentille, traitée dans une caméra CCD et transformée en image numérique.

Mais nous parlerons de l'acquisition d'images de cellules plus tard. Maintenant, nous devrions vous présenter des exemples et des conseils pour les principales étapes avant l'acquisition de votre image.

Comment choisir et combiner différents types de colorants et d'anticorps, pour voir et comprendre les relations entre les organelles et les protéines à l'intérieur des cellules ou des tissus ?

Tout d'abord, les scientifiques doivent déterminer les anticorps et les colorants à utiliser en fonction de leurs recherches.

Par exemple, dans cet articleDans le cadre d'un projet de recherche, Mendonça a tenté d'évaluer les effets et les risques potentiels des nanoparticules lipidiques solides cationiques (NPFSc) chez le rat. De nombreuses nanoparticules sont développées et étudiées chaque année, dans le but d'améliorer l'administration de médicaments ou de gènes pour traiter de nombreuses maladies. L'une des questions intéressantes de cette étude était de savoir si les nanoparticules étaient capables d'atteindre le cerveau en traversant la barrière hémato-encéphalique. Cette barrière protège notre cerveau des toxines ou des agents pathogènes en circulation et, en général, il n'est pas souhaitable que des molécules traversent cette barrière. Mais dans ce cas particulier, Mendonça L'objectif était que les nanoparticules traversent la barrière et atteignent le cerveau, afin de délivrer des médicaments ou des gènes dans une application future.

Voulant voir si les nanoparticules étaient présentes dans le parenchyme cérébral, les auteurs ont utilisé un marqueur de cellules endothéliales pour les vaisseaux appelé RECA-1 (représenté en rouge), tandis que les noyaux des cellules ont été colorés avec un colorant appelé DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) qui est bleu. Nous pouvons également observer des petits points verts pour les nanoparticules à l'extérieur des vaisseaux, ce qui signifie qu'elles ont atteint le parenchyme cérébral.

Consultez l'infographie ci-dessous avec une image de représentation.

Infographie Mind the Graph : comment concevoir un panel pour l'immunofluorescence

Comprenons ce que fait l'anticorps pour RECA-1 (rouge).

Ces anticorps sont conçus pour servir de sondes spécifiques, et ils ciblent un antigène spécifique (dans notre cas, la protéine RECA-1).

Ils peuvent être marqués par un fluorophore ou reconnus ultérieurement par un anticorps secondaire lié à un fluorophore.

Par conséquent, après avoir excité l'échantillon avec une source de lumière, la protéine spécifique que vous recherchez sera reconnue dans votre échantillon par l'émission de lumière dans une longueur d'onde spécifique..

Dans le cas du DAPI, ce colorant est la contre-coloration des noyaux et des nucléosomes, et il émet une fluorescence bleue lorsqu'il se lie aux régions AT de l'ADN.

Comment concevoir un panel pour l'immunofluorescence ?

Commencez par ces étapes :

Achetez (ou empruntez ! La science devrait être très collaborative !) les anticorps et les colorants essentiels à votre recherche. Privilégiez les anticorps primaires (sans sondes), et achetez des anticorps secondaires spécifiques de l'espèce hôte de l'anticorps primaire. Par exemple, si vous utilisez un anticorps primaire produit chez le lapin, utilisez un anticorps secondaire anti-lapin. Cela garantira la spécificité.
L'utilisation d'anticorps secondaires marqués avec des fluorophores améliorera votre signal en détectant plus d'antigènes par anticorps primaire. En outre, il s'agit d'un moyen plus dynamique d'élaborer différents tests, car il permet au chercheur de modifier les couleurs du panel en fonction de ses besoins.
Une autre étape importante consiste à vérifier dans votre microscope quels sont les filtres disponibles pour l'utilisation. Vous devez vous assurer que les longueurs d'onde d'excitation et d'émission de votre fluorophore se situent à l'intérieur des filtres d'excitation et d'émission ; sinon, vous ne pourrez pas capturer la lumière d'émission de vos sondes. Vous pouvez utiliser Visualiseur de spectres de fluorescence pour vérifier la compatibilité.
Pour s'assurer que les longueurs d'onde d'excitation et d'émission de tous vos fluorophores et colorants ne se chevauchent pas dans le même essai, Visualiseur de spectres de fluorescence est un excellent choix. Ils couvrent presque tous les fluorophores disponibles !

Enfin, vérifiez un exemple pour une expérience hypothétique où nous avons du Hoechst 33258 pour les acides nucléiques, et un anticorps primaire contre RECA-1 marqué avec un anticorps secondaire Alexa Fluor 647.

Idéalement, nous utiliserions un microscope disponible avec un cube de DAPI (excitation 377/50 et émission 447/60), et un cube de CY5 (excitation 628/40 et émission 685/40). Toutes ces informations, nous les avons insérées à Visualiseur de spectres de fluorescence et obtenu les spectres des deux colorants, ainsi que les largeurs de bande des deux cubes (voir le spectre dans l'infographie ci-dessus).

Cet essai hypothétique est un bon exemple où les spectres des fluorophores se trouvent à l'intérieur des filtres d'excitation et d'émission, ce qui permet au chercheur de capturer ses échantillons de la meilleure façon possible.

Maintenant, il est temps d'aller au laboratoire et de mettre tout en pratique !

J'espère que ces conseils vous aideront lors de votre prochaine expérience de laboratoire. Bonne chance !

Références :

Introduction à la microscopie à fluorescence. Microscopie de NikonU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . Accédé le 2021-04-11 17:20:40.

Microscopie : Comment les scientifiques utilisent la fluorescence pour voir à l'intérieur des cellules

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