Микроскопия: Как учените използват флуоресценцията, за да видят вътрешността на клетките -

Голяма част от работата на учените е да проектират и провеждат експерименти.

Комбинацията от лабораторни методи ще даде отговор на повечето въпроси, предложени от учените, а работният процес за предлагане на нови методи зависи от образованието и опита на учените.

За биолозите клетъчните изображения могат да кажат много за това какво се случва с процесите и механизмите, които изучават.

Светлинна микроскопия е много разпространена техника в биологичните науки.

Използването на багрила, антитела и флуоресцентни сонди позволява на учените да видят в клетките на микроскопа изображения на това, което иначе е било твърде малко, за да бъде видяно и дори разбрано.

Флуоресцентни микроскопи и използването на флуорохроми става възможно през 1930 г.¹, а днес са възможни много комбинации от флуорохроми за оцветяване на протеини, органели и структури в клетките и тъканите.

Флуорохроми (или флуорофори) са молекули, които при възбуждане с определена дължина на вълната на светлината излъчват светлина с определена дължина на вълната, която се улавя от лещите на микроскопа и се превръща в реално изображение.

Комбинацията от флуоресценция, лещи и камери ни дава възможност да правим снимки на процесите в клетките в много различни гледни точки и аспекти.

Например, използвайки микроскопа, имаме по-широк поглед върху парче мозък на мишка с обектив 2,5х или 4х и малки детайли от изследвания актинов цитоскелет в същата проба с обектив 63х.

За тези анализи можем да използваме антитела или багрила срещу специфични протеини, присъстващи в клетката или тъканта, като антителата обикновено са снабдени с флуорофор.

Преместването на Стокс обяснява това явление: флуорофорите губят вибрационна енергия под формата на излъчена светлина, когато преминават от възбудено състояние обратно в основно състояние. Флуоресцентните микроскопи осигуряват светлина за възбуждане на флуорофора и приемат излъчената от него светлина. Излъчената светлина може да бъде уловена от обектив, обработена в CCD камера и преобразувана в цифрово изображение.

Но нека поговорим за придобиването на клетъчни изображения по-късно. Сега трябва да ви запознаем с примери и съвети за основните стъпки преди придобиването на изображението.

Как избираме и комбинираме различни видове багрила и антитела, за да видим и разберем връзките между органели и протеини в клетките или тъканите?

Първо, учените трябва да определят кои антитела и багрила да използват въз основа на своите изследвания.

Например, в тази статия, Мендонса се опитва да оцени ефектите и потенциалните рискове от катионни твърди липидни наночастици (cSLNs) при плъхове. Всяка година се разработват и изучават много наночастици, чиято цел е да подобрят доставката на лекарства или гени за лечение на много заболявания. Един от интересните въпроси в това проучване е дали наночастиците са в състояние да достигнат до мозъка, като преминат кръвно-мозъчната бариера. Тази бариера предпазва мозъка ни от циркулиращи токсини или патогени и обикновено не е желателно молекулите да преминават бариерата. Но в този конкретен случай, Mendonça's Целта е наночастиците да преминат бариерата и да достигнат до мозъка, за да доставят лекарства или гени в бъдеще.

В желанието си да проверят дали наночастиците присъстват в мозъчния паренхим, авторите използват маркер на ендотелните клетки за съдовете, наречен RECA-1 (представен в червено), а клетъчните ядра са оцветени с багрило, наречено DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол), което е синьо. Можем да наблюдаваме и малки зелени точки за наночастиците извън съдовете, което означава, че те са достигнали до мозъчния паренхим.

Разгледайте инфографиката по-долу с изображението за представяне.

Mind the Graph инфографика как да създадем панел за имунофлуоресценция

Нека разберем какво прави антитялото за RECA-1 (червено).

Тези антитела са проектирани да служат като специфични сонди и са насочени към специфичен антиген (в нашия случай - протеина RECA-1).

Те могат да бъдат маркирани с флуорофор или разпознати по-късно от вторично антитяло, свързано с флуорофор.

Затова след възбуждане на пробата със светлинен източник, специфичният протеин, който търсите, ще бъде разпознат в пробата ви чрез излъчване на светлина с определена дължина на вълната..

В случая с DAPI това багрило е контрастайн за ядра и нуклеозоми и излъчва синя флуоресценция, когато се свърже с АТ-области на ДНК.

Как да създадем панел за имунофлуоресценция?

Започнете с тези стъпки:

Купете (или вземете назаем! Науката трябва да бъде много съвместна!) антитела и багрила, необходими за вашите изследвания. Отдавайте предпочитание на първичните антитела (без сонди) и купувайте вторични антитела, специфични за вида гостоприемник от първичното антитяло. Например, ако използвате първично антитяло, произведено при зайци, използвайте вторично антитяло за анти-зайци. Това ще гарантира специфичност.
Използването на вторични антитела, маркирани с флуорофори, ще подобри сигнала ви, като открие повече антигени на едно първично антитяло. Освен това това е по-динамичен начин за разработване на различни анализи, тъй като позволява на изследователя да променя цветовете в панела в зависимост от нуждите си.
Друга важна стъпка е да проверите в микроскопа си какви филтри можете да използвате. Трябва да се уверите, че дължините на вълните на възбуждане и излъчване на вашите флуорофори попадат във филтрите за възбуждане и излъчване; в противен случай няма да можете да уловите емисионната светлина от вашите сонди. Можете да използвате Преглед на флуоресцентни спектри за да проверите съвместимостта.
За да сте сигурни, че дължините на вълните на възбуждане и излъчване на всички ваши флуорофори и багрила не се припокриват в един и същи тест, Преглед на флуоресцентни спектри е чудесен избор. Те покриват почти всички налични флуорофори!

И накрая, проверете пример за хипотетичен експеримент, в който имаме Hoechst 33258 за нуклеиновите киселини и първично антитяло срещу RECA-1, маркирано с вторично антитяло Alexa Fluor 647.

В идеалния случай бихме използвали микроскоп с кубче DAPI (възбуждане 377/50 и излъчване 447/60) и кубче CY5 (възбуждане 628/40 и излъчване 685/40). Цялата тази информация е поместена в Преглед на флуоресцентни спектри и получих спектрите на двете багрила и ширината на честотната лента за двата куба (вижте спектъра в инфографиката по-горе).

Този хипотетичен есемес е добър пример, при който спектрите на флуорофорите попадат във възбуждащия и емисионния филтър, което дава възможност на изследователя да улови пробите си по най-добрия възможен начин.

Сега е време да отидете в лабораторията и да приложите всичко на практика!

Надявам се тези съвети да ви помогнат при следващия ви лабораторен експеримент. Успех!

Препратки:

Въведение във флуоресцентната микроскопия. Микроскопия на NikonU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy . Достъпно на 2021-04-11 17:20:40.

Микроскопия: Как учените използват флуоресценцията, за да видят вътрешността на клетките

Абонирайте се за нашия бюлетин