Η δοκιμή RT-PCR για τον κοροναϊό

Από πολλά πράγματα που έχετε ακούσει για τον COVID-19 το 2020, ένα πράγμα που βρίσκεται στη μέση όλων αυτών είναι η εξέταση που χρησιμοποιείται για να ανιχνεύσει αν κάποιος έχει μολυνθεί από τον ιό, η περίφημη εξέταση RT-PCR ή μόνο PCR.

Σίγουρα, έχετε ήδη ακούσει γι' αυτό το τεστ στο παρελθόν, από κάποιον επαγγελματία του ιατρικού τομέα ή στις ειδήσεις. Το τεστ PCR χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της παρουσίας (ή μη) του ιού στο σώμα κάποιου.

Η εξέταση RT-PCR δεν είναι η μόνη που μπορεί να ανιχνεύσει τον ιό, αλλά είναι, σε σύγκριση με τις άλλες μεθόδους, η πιο ακριβής και αξιόπιστη. Μια άλλη εξέταση είναι η συμβατική ορολογική εξέταση που ανιχνεύει συγκεκριμένα επίπεδα αντισωμάτων σε δείγματα αίματος.

Τα γράμματα στην RT-PCR, σημαίνουν Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με αντίστροφη μεταγραφή, χρησιμοποιείται εδώ και δεκαετίες από τους επιστήμονες για την παραγωγή πολλαπλών αντιγράφων γενετικού υλικού.

Με άλλα λόγια, σε αυτή την περίπτωση, περισσότερο γενετικό υλικό από τον SARS-CoV-2, το οποίο χρησιμοποιείται ως δακτυλικό αποτύπωμα για την πιστοποίηση της παρουσίας του ιού σε δείγματα από τη μύτη, τα αυτιά ή το σάλιο που συλλέγονται από ασθενείς. Εάν υπάρχουν ιοί κρυμμένοι στο δείγμα, ακόμη και σε μικρές ποσότητες, θα είναι σε θέση να ανιχνεύσει λόγω του κύκλου αντιγραφής-επικόλλησης. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο το τεστ RT-PCR είναι τόσο αξιόπιστο.

Το τεστ είναι μια μέθοδος με βασικά δύο βήματα μέσα σε κύκλο θερμοκρασίας, η οποία κάνει μια διαδικασία αντιγραφής-επικόλλησης ενός κομματιού γενετικού υλικού, είτε πρόκειται για DNA είτε για RNA.

Το τεστ απαιτεί μηχανή θερμοκυκλοποιητή η οποία έχει ακριβή έλεγχος θερμοκρασίας και χρόνου. Μέσω πολλαπλών κύκλων θερμοκρασίας το γενετικό υλικό του ιού θα αυξηθεί. Στη συνέχεια παρουσιάζεται ένα παράδειγμα κύκλου θερμοκρασίας.

Η μέθοδος απαιτεί δύο βασικά ένζυμα, την αντίστροφη μεταγραφάση (γι' αυτό το "RT" στον τίτλο) και την DNA-πολυμεράση. Καθένα από αυτά έχει μια φάση δράσης και μια λειτουργία. Στο παραπάνω σχήμα, η κίτρινη φάση του κύκλου είναι όταν δρα η RT και η κόκκινη φάση είναι όταν η DNA-πολυμεράση κάνει τη δουλειά της.

Το πρώτο ένζυμο δημιουργεί τη συμπληρωματική αλυσίδα DNA από τον ιό RNA, επιτρέποντας στο δεύτερο ένζυμο να εκτελέσει το έργο της αντιγραφής-επικόλλησης από τη νέα αλυσίδα DNA που μόλις δημιουργήθηκε, αυξάνοντας την ποσότητα του γενετικού υλικού που υπάρχει. Αυτή η ενίσχυση καθιστά δυνατό τον χαρακτηρισμό και/ή τον χειρισμό του γενετικού υλικού, όταν σε μικρότερη ποσότητα δεν θα ήταν δυνατό.

Για να συμβεί όλη αυτή η διαδικασία, τα ένζυμα χρειάζονται τη βοήθεια ενός μικρού (ή μεγάλου) μορίου που ονομάζεται PRIMER. Η λειτουργία του εκκινητή είναι να υποδεικνύει τη θέση όπου το ένζυμο πρέπει να αρχίσει να επεκτείνει τις αλυσίδες, χωρίς αυτόν δεν θα ξεκινήσει η διαδικασία αντιγραφής-επικόλλησης της DNA-πολυμεράσης.

Το αστάρι μπορεί να επιλεγεί με τυχαίο ή συγκεκριμένο σχήμα. Είναι πολύ σημαντικό να γνωρίζουμε τον γενετικό χάρτη του ιού σε περιπτώσεις όπως αυτή, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν συγκεκριμένοι εκκινητές για να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα και η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων.

Αν είστε περίεργοι όπως εμείς και θέλετε να μάθετε περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με την RT-PCR, μπορείτε να δείτε περισσότερες λεπτομέρειες αυτό το επιστημονικό άρθρο ακριβώς εδώ αλλά στην ουσία εδώ είναι όλα όσα χρειάζονται για να γίνει η δοκιμή:

Το γενετικό υλικό του ιού, το RNA

Αντίστροφη μεταγραφάση και ένζυμα DNA-πολυμεράσης

PRIMERS

Τριφωσφορικά νουκλεοζίτες

Και φθορίζουσες χρωστικές αναφοράς:

Για να γνωρίζουμε τα αποτελέσματα ενός δείγματος που μπορεί να είναι ή να μην είναι μολυσμένο με τον ιό COVID-19, χρησιμοποιείται η ανάλυση με φθορίζουσες χρωστικές αναφοράς σε συνδυασμό με τη δοκιμή RT-PCR. Η δοκιμασία βασίζεται στην παρουσία ή μη του φθορίζοντος σήματος ενός δείγματος. Σε περίπτωση απουσίας σήματος η εξέταση μπορεί να συναχθεί ως αρνητική ή ψευδώς αρνητική. Με την παρουσία έντονου σήματος μπορεί να συναχθεί όχι μόνο θετικό συμπέρασμα για την παρουσία του ιού αλλά και ως νόσος σε προχωρημένο στάδιο.

Ανακατέψτε όλα τα υλικά και βάλτε τα στη θερμοκυκλική μηχανή.

Το πρώτο βήμα του τεστ παρουσιάζεται στο επόμενο infographic. Το ένζυμο RT δημιουργεί το πρώτο αντίγραφο του γενετικού υλικού του ιού που υπάρχει στο δείγμα. Στη συνέχεια βλέπετε το δεύτερο βήμα της μεθόδου RT-PCR. Ο εκκινητής υποδεικνύει τη θέση έναρξης και η DNA-πολυμεράση μέσω ενζυμικής αντίδρασης αρχίζει να επεκτείνει τις αλυσίδες του DNA.

Τέλος, αυτή η εικόνα είναι μια εικόνα ηλεκτρονικής μικρογραφίας του ιού SARS-CoV-2 και είναι δυνατόν να διακρίνει κανείς τέλεια τη δομή του ιού. Δεν είναι πανέμορφο;

Το τεστ είναι πολύπλοκο και δεν είναι τόσο απλό όσο φαίνεται, αλλά βάζω στοίχημα ότι με τα infographics ήταν πολύ πιο εύκολο να καταλάβετε τη μεγάλη εικόνα του πώς λειτουργεί, σωστά;

Μπορείτε να το κάνετε αυτό με οποιαδήποτε επιστημονική πληροφορία θέλετε χρησιμοποιώντας Mind the Graph. Η πλατφόρμα είναι εδώ για να σας δώσει την αυτονομία να επικοινωνείτε καλύτερα τις επιστημονικές πληροφορίες. Μάθετε περισσότερα σχετικά με τον τρόπο χρήσης της πλατφόρμας και αν χρειάζεστε οποιαδήποτε βοήθεια επικοινωνήστε μαζί μας.!

Αναφορά

AI, T. et al. Correlation of Chest CT and RT-PCR Testing for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) in China: A Report of 1014 Cases. Radiology, v. 296, n. 2, p. E32-E40, 26 fev. 2020.

GIBELLINI, D. et al. Ποσοτική ανίχνευση του ιικού φορτίου του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 (HIV-1) με την τεχνική SYBR green real-time RT-PCR σε οροθετικούς ασθενείς με HIV-1. Journal of Virological Methods, v. 115, n. 2, p. 183-189, 1 fev. 2004.

JAMES, D. Απλό και αξιόπιστο πρωτόκολλο για την ανίχνευση του ιού της αυλάκωσης του στελέχους της μηλιάς με RT-PCR και σε δοκιμή πολλαπλής PCR. Journal of Virological Methods, v. 83, n. 1, p. 1-9, 1 dez. 1999.

LI, Y. et al. Ζητήματα σταθερότητας των δοκιμών RT-PCR του SARS-CoV-2 για νοσηλευόμενους ασθενείς με κλινική διάγνωση COVID-19. Journal of Medical Virology, v. 92, n. 7, p. 903-908, 2020.

LIAO, C.-S. et al. Μικροσκοπικό σύστημα RT-PCR για τη διάγνωση ιών με βάση το RNA. Nucleic Acids Research, v. 33, n. 18, p. e156-e156, 1 out. 2005.

MOHAN, A. et al. Επιπολασμός της ιογενούς λοίμωξης που ανιχνεύεται με PCR και RT-PCR σε ασθενείς με οξεία παρόξυνση της ΧΑΠ: συστηματική ανασκόπηση. Respirology, v. 15, n. 3, p. 536-542, 2010.

NOLAN, T., HANDS, R. E., BUSTIN, S. A. Ποσοτικοποίηση του mRNA με τη χρήση RT-PCR σε πραγματικό χρόνο. Nature Protocols, v. 1, n. 3, p. 1559-1582, πριν. 2006.

Νέος κοροναϊός SARS-CoV-2 | Αυτό το ηλεκτρονικό μι... | Flickr. Disponível em: . Acesso em: 23 jul. 2020.

Η δοκιμή RT-PCR για τον κοροναϊό

Εγγραφείτε στο ενημερωτικό μας δελτίο

Σχετικά με τον Fabricio Pamplona