Med hj\u00e4lp av f\u00e4rg\u00e4mnen, antikroppar och fluorescerande prober kan forskarna i mikroskopcellerna se bilder av det som annars var f\u00f6r litet f\u00f6r att kunna ses eller ens uppfattas.<\/p>\n\n\n\n
Fluorescensmikroskop<\/strong> och anv\u00e4ndning av fluorokromer blev m\u00f6jligt 19301<\/sup><\/a>och idag kan man anv\u00e4nda m\u00e5nga olika kombinationer av fluorokromer f\u00f6r att f\u00e4rga proteiner, organeller och strukturer i celler och v\u00e4vnader.<\/p>\n\n\n\n Fluorokromer (eller fluoroforer)<\/strong> \u00e4r molekyler som n\u00e4r de exciteras med en specifik v\u00e5gl\u00e4ngd avger ljus med en definierad v\u00e5gl\u00e4ngd som f\u00e5ngas upp av linserna i ett mikroskop och omvandlas till en faktisk bild.<\/p>\n\n\n\n Kombinationen av fluorescens, linser och kameror g\u00f6r att vi kan ta en bild av processer inuti celler ur m\u00e5nga olika synvinklar och aspekter.<\/p>\n\n\n\n Med ett mikroskop kan vi t.ex. f\u00e5 en bredare bild av en mushj\u00e4rna i ett 2,5x eller 4x objektiv, och sm\u00e5 detaljer av det unders\u00f6kta aktincytoskelettet i samma prov med ett 63x objektiv.<\/p>\n\n\n\n F\u00f6r att m\u00f6jligg\u00f6ra dessa analyser kan vi anv\u00e4nda antikroppar eller f\u00e4rg\u00e4mnen mot specifika proteiner som finns i cellen eller v\u00e4vnaden, och antikroppen har vanligtvis en fluorofor.<\/p>\n\n\n\n Stokes skift f\u00f6rklarar detta fenomen: fluoroforer f\u00f6rlorar vibrationsenergi i form av uts\u00e4nt ljus n\u00e4r de g\u00e5r fr\u00e5n ett exciterat tillst\u00e5nd tillbaka till grundtillst\u00e5ndet. Fluorescensmikroskop ger ljus f\u00f6r att excitera fluoroforen och tar emot dess uts\u00e4nda ljus. Det uts\u00e4nda ljuset kan f\u00e5ngas upp av en lins, bearbetas i en CCD-kamera och omvandlas till en digital bild.<\/p>\n\n\n\n Men l\u00e5t oss prata om cellbildstagning senare. Nu ska vi presentera exempel och tips f\u00f6r de viktigaste stegen innan du tar din bild.<\/p>\n\n\n\n Hur v\u00e4ljer och kombinerar vi olika typer av f\u00e4rg\u00e4mnen och antikroppar f\u00f6r att se och f\u00f6rst\u00e5 sambanden mellan organeller och proteiner i celler eller v\u00e4vnader?<\/p>\n\n\n\n F\u00f6rst m\u00e5ste forskarna best\u00e4mma vilka antikroppar och f\u00e4rg\u00e4mnen som ska anv\u00e4ndas baserat p\u00e5 deras forskning.<\/p>\n\n\n\n Till exempel, i denna artikel<\/a>f\u00f6rs\u00f6kte Mendon\u00e7a utv\u00e4rdera effekterna och de potentiella riskerna med katjoniska fasta lipidnanopartiklar (cSLN) i r\u00e5ttor. M\u00e5nga nanopartiklar utvecklas och studeras varje \u00e5r, i syfte att f\u00f6rb\u00e4ttra leveransen av l\u00e4kemedel eller gener f\u00f6r att behandla m\u00e5nga sjukdomar. En av de intressanta fr\u00e5gorna i den h\u00e4r studien var om nanopartiklarna kunde n\u00e5 hj\u00e4rnan genom att passera blod-hj\u00e4rnbarri\u00e4ren. Denna barri\u00e4r skyddar v\u00e5r hj\u00e4rna fr\u00e5n cirkulerande toxiner eller patogener, och vanligtvis \u00e4r det inte \u00f6nskv\u00e4rt att molekyler korsar barri\u00e4ren. Men i detta speciella fall, Mendon\u00e7as<\/a> M\u00e5let var att nanopartiklarna skulle passera barri\u00e4ren och n\u00e5 hj\u00e4rnan, f\u00f6r att i en framtida till\u00e4mpning kunna leverera l\u00e4kemedel eller gener.<\/p>\n\n\n\n F\u00f6r att se om nanopartiklarna fanns i hj\u00e4rnparenkymet anv\u00e4nde f\u00f6rfattarna en endotelcellsmark\u00f6r f\u00f6r k\u00e4rlen som heter RECA-1 (visas i r\u00f6tt), medan cellk\u00e4rnorna f\u00e4rgades med ett f\u00e4rg\u00e4mne som heter DAPI (4\u2032,6-diamidino-2-phenylindole) som \u00e4r bl\u00e5tt. Vi kan ocks\u00e5 observera sm\u00e5 gr\u00f6na prickar f\u00f6r nanopartiklarna utanf\u00f6r k\u00e4rlen, vilket inneb\u00e4r att de n\u00e5dde hj\u00e4rnparenkym.<\/p>\n\n\n\n Kolla in infografiken nedan med en representativ bild.<\/p>\n\n\n L\u00e5t oss f\u00f6rst\u00e5 vad antikroppen f\u00f6r RECA-1 (r\u00f6d) g\u00f6r.<\/p>\n\n\n\n Dessa antikroppar \u00e4r utformade f\u00f6r att fungera som specifika prober, och de riktar in sig p\u00e5 en specifik antigen (i v\u00e5rt fall proteinet RECA-1).<\/p>\n\n\n\n De kan m\u00e4rkas med en fluorofor eller senare k\u00e4nnas igen av en sekund\u00e4r antikropp som \u00e4r kopplad till en fluorofor.<\/p>\n\n\n\n Efter att provet har aktiverats med en ljusk\u00e4lla, det specifika protein du letar efter kommer att k\u00e4nnas igen i ditt prov genom emission av ljus i en specifik v\u00e5gl\u00e4ngd<\/a>.<\/p>\n\n\n\n N\u00e4r det g\u00e4ller DAPI \u00e4r detta f\u00e4rg\u00e4mne motf\u00e4rgning av k\u00e4rnor och nukleosomer, och det avger bl\u00e5 fluorescens n\u00e4r det binds till AT-regioner i DNA.<\/p>\n\n\n\n Hur utformar man en panel f\u00f6r immunofluorescens? <\/strong><\/p>\n\n\n\n B\u00f6rja med dessa steg:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Kontrollera slutligen ett exempel p\u00e5 ett hypotetiskt experiment d\u00e4r vi har Hoechst 33258 f\u00f6r nukleinsyrorna och en prim\u00e4r antikropp mot RECA-1 m\u00e4rkt med en sekund\u00e4r antikropp Alexa Fluor 647.<\/p>\n\n\n\n Helst skulle vi anv\u00e4nda ett mikroskop med en DAPI-kub (excitation 377\/50 och emission 447\/60) och en CY5-kub (excitation 628\/40 och emission 685\/40). All denna information finns p\u00e5 Visare f\u00f6r fluorescensspektra<\/a> och fick fram spektrumet f\u00f6r b\u00e5da f\u00e4rg\u00e4mnena och bandbredden f\u00f6r b\u00e5da kuberna (se spektrumet i infografiken ovan).<\/p>\n\n\n\n Denna hypotetiska uppsats \u00e4r ett bra exempel d\u00e4r fluoroforernas spektra h\u00f6r hemma i excitations- och emissionsfiltren, vilket g\u00f6r det m\u00f6jligt f\u00f6r forskaren att f\u00e5nga sina prover p\u00e5 b\u00e4sta m\u00f6jliga s\u00e4tt.<\/p>\n\n\n\n Nu \u00e4r det dags att g\u00e5 till labbet och oms\u00e4tta allt i praktiken!<\/p>\n\n\n\n Jag hoppas att dessa tips hj\u00e4lper dig med ditt n\u00e4sta labbf\u00f6rs\u00f6k. Lycka till!<\/p>\n\n\n\n Referenser:<\/strong><\/p>\n\n\n\n En stor del av en forskares vardag best\u00e5r av att utforma och utf\u00f6ra experiment. Kombinationen av laboratorietekniker svarar p\u00e5 de flesta av forskarnas fr\u00e5gor, och arbetsfl\u00f6det f\u00f6r att f\u00f6resl\u00e5 nya metoder beror p\u00e5 forskarens bakgrund och erfarenhet. F\u00f6r biologer kan cellbilder s\u00e4ga en hel del om vad som h\u00e4nder med [...].<\/p>","protected":false},"author":18,"featured_media":12982,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[66,959,958,28,38],"tags":[51,554,962],"yoast_head":"\n![\"Mind](\"https:\/\/mindthegraph.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/preview-347880-7-788x1024.png\")
<\/a><\/figure><\/div>\n\n\n\n
\n