Uporaba barvil, protiteles in fluorescen\u010dnih sond znanstvenikom omogo\u010da, da v celicah mikroskopa vidijo slike, ki so sicer premajhne, da bi jih lahko videli in celo razumeli.<\/p>\n\n\n\n
Fluorescen\u010dni mikroskopi<\/strong> in uporabo fluorohromov postala mogo\u010da leta 1930.1<\/sup><\/a>, danes pa so mo\u017ene \u0161tevilne kombinacije fluorohromov za barvanje proteinov, organelov ter struktur v celicah in tkivih.<\/p>\n\n\n\n Fluorohromi (ali fluorofori)<\/strong> so molekule, ki ob vzbujanju svetlobe dolo\u010dene valovne dol\u017eine oddajajo svetlobo dolo\u010dene valovne dol\u017eine, ki jo zajamejo le\u010de mikroskopa in pretvorijo v dejansko sliko.<\/p>\n\n\n\n Kombinacija fluorescence, le\u010d in kamer nam omogo\u010da, da posnamemo slike procesov v celicah z razli\u010dnih vidikov.<\/p>\n\n\n\n Z mikroskopom imamo na primer \u0161ir\u0161i pogled na rezino mi\u0161jih mo\u017eganov z 2,5-kratnim ali 4-kratnim objektivom, z 63-kratnim objektivom pa lahko v istem vzorcu opazujemo majhne podrobnosti o prou\u010devanem aktinskem citoskeletu.<\/p>\n\n\n\n Za te teste lahko uporabimo protitelesa ali barvila proti specifi\u010dnim proteinom, ki so prisotni v celici ali tkivu, protitelesa pa so obi\u010dajno opremljena s fluoroforjem.<\/p>\n\n\n\n Stokesov premik pojasnjuje ta pojav: fluorofori izgubijo vibracijsko energijo v obliki oddane svetlobe, ko preidejo iz vzbujenega stanja nazaj v osnovno stanje. Fluorescen\u010dni mikroskopi zagotavljajo svetlobo za vzbujanje fluorofora in sprejemajo njegovo oddano svetlobo. Emitirano svetlobo je mogo\u010de zajeti z objektivom, obdelati v kameri CCD in pretvoriti v digitalno sliko.<\/p>\n\n\n\n O pridobivanju slik celic pa bomo govorili pozneje. Zdaj vam moramo predstaviti primere in nasvete za glavne korake pred pridobivanjem slike.<\/p>\n\n\n\n Kako izberemo in kombiniramo razli\u010dne vrste barvil in protiteles, da vidimo in razumemo odnose med organeli in proteini v celicah ali tkivih?<\/p>\n\n\n\n Znanstveniki morajo najprej dolo\u010diti, katera protitelesa in barvila bodo uporabili na podlagi svojih raziskav.<\/p>\n\n\n\n Na primer, v tem \u010dlanku<\/a>Mendon\u00e7a je posku\u0161al oceniti u\u010dinke in morebitna tveganja kationskih trdnih lipidnih nanodelcev (cSLN) pri podganah. Vsako leto se razvijajo in preu\u010dujejo \u0161tevilni nanodelci, katerih cilj je izbolj\u0161ati dostavo zdravil ali genov za zdravljenje \u0161tevilnih bolezni. Eno od zanimivih vpra\u0161anj v tej \u0161tudiji je bilo, ali lahko nanodelci dose\u017eejo mo\u017egane, tako da pre\u010dkajo krvno-mo\u017egansko pregrado. Ta pregrada varuje na\u0161e mo\u017egane pred kro\u017ee\u010dimi toksini ali patogeni in obi\u010dajno ni za\u017eeleno, da bi molekule pre\u010dkale to pregrado. Toda v tem posebnem primeru, Mendon\u00e7a's<\/a> cilj je bil, da nanodelci prestopijo pregrado in dose\u017eejo mo\u017egane, da bi lahko v prihodnosti uporabljali zdravila ali gene.<\/p>\n\n\n\n Ker so \u017eeleli preveriti, ali so nanodelci prisotni v mo\u017eganskem parenhimu, so avtorji uporabili ozna\u010devalec endotelijskih celic za \u017eile, imenovan RECA-1 (prikazan z rde\u010do barvo), medtem ko so celi\u010dna jedra obarvali z barvilom DAPI (4\u2032,6-diamidino-2-fenilindol), ki je modre barve. Opazimo lahko tudi majhne zelene pike za nanodelce zunaj \u017eil, kar pomeni, da so dosegli mo\u017eganski parenhim.<\/p>\n\n\n\n Oglejte si spodnjo infografiko s predstavitveno sliko.<\/p>\n\n\n Razumemo, kaj po\u010dne protitelo za RECA-1 (rde\u010de).<\/p>\n\n\n\n Ta protitelesa so zasnovana kot specifi\u010dne sonde in so usmerjena proti specifi\u010dnemu antigenu (v na\u0161em primeru proti beljakovini RECA-1).<\/p>\n\n\n\n Ozna\u010dimo jih lahko s fluoroforjem ali jih kasneje prepoznamo s sekundarnim protitelesom, povezanim s fluoroforjem.<\/p>\n\n\n\n Zato po vzbujanju vzorca z virom svetlobe, dolo\u010den protein, ki ga i\u0161\u010dete, bo v va\u0161em vzorcu prepoznan po oddajanju svetlobe dolo\u010dene valovne dol\u017eine.<\/a>.<\/p>\n\n\n\n V primeru DAPI je to barvilo kontrastin za jedra in nukleosome in oddaja modro fluorescenco, ko se ve\u017ee na obmo\u010dja AT v DNK.<\/p>\n\n\n\n Kako oblikovati panel za imunofluorescenco? <\/strong><\/p>\n\n\n\n Za\u010dnite s temi koraki:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Na koncu preverite primer hipoteti\u010dnega poskusa, v katerem imamo Hoechst 33258 za nukleinske kisline in primarno protitelo proti RECA-1, ozna\u010deno s sekundarnim protitelesom Alexa Fluor 647.<\/p>\n\n\n\n Najbolje bi bilo uporabiti mikroskop, ki ima na voljo kocko DAPI (ekscitacija 377\/50 in emisija 447\/60) in kocko CY5 (ekscitacija 628\/40 in emisija 685\/40). Vse te informacije smo vstavili na Pregledovalnik fluorescen\u010dnih spektrov<\/a> in pridobili spektre obeh barvil ter pasovne \u0161irine obeh kock (oglejte si spekter v zgornji infografiki).<\/p>\n\n\n\n Ta hipoteti\u010dni esej je dober primer, kjer spektri fluoroforjev spadajo v vzbujalni in emisijski filter, kar raziskovalcu omogo\u010da, da svoje vzorce zajame na najbolj\u0161i mo\u017eni na\u010din.<\/p>\n\n\n\n Zdaj je \u010das, da se odpravite v laboratorij in vse skupaj uporabite v praksi!<\/p>\n\n\n\n Upam, da vam bodo ti nasveti pomagali pri naslednjem laboratorijskem poskusu. Veliko sre\u010de!<\/p>\n\n\n\n Reference:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Velik del znanstvenikovega dela je na\u010drtovanje in izvajanje poskusov. Kombinacija laboratorijskih tehnik bo odgovorila na ve\u010dino vpra\u0161anj, ki jih predlagajo znanstveniki, delovni proces za predlaganje novih metod pa je odvisen od znanstvenikovega predznanja in izku\u0161enj. Za biologe lahko slike celic veliko povedo o tem, kaj se dogaja s celicami in kaj je z njimi [...]<\/p>","protected":false},"author":18,"featured_media":12982,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[66,959,958,28,38],"tags":[51,554,962],"yoast_head":"\n![\"Mind](\"https:\/\/mindthegraph.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/preview-347880-7-788x1024.png\")
<\/a><\/figure><\/div>\n\n\n\n
\n