Utilizarea coloran\u021bilor, a anticorpilor \u0219i a sondelor fluorescente le permite oamenilor de \u0219tiin\u021b\u0103 s\u0103 vad\u0103 \u00een celulele microscopului imagini a ceea ce altfel era prea mic pentru a fi v\u0103zut \u0219i chiar \u00een\u021beles.<\/p>\n\n\n\n
Microscoape cu fluorescen\u021b\u0103<\/strong> \u0219i utilizarea de fluorocromi a devenit posibil\u0103 \u00een 19301<\/sup><\/a>, iar ast\u0103zi sunt posibile multe combina\u021bii de fluorocromi pentru a colora proteine, organite \u0219i structuri din celule \u0219i \u021besuturi.<\/p>\n\n\n\n Fluorocromi (sau fluorofori)<\/strong> sunt molecule care, atunci c\u00e2nd sunt excitate cu o anumit\u0103 lungime de und\u0103 de lumin\u0103, emit lumin\u0103 cu o lungime de und\u0103 definit\u0103 care va fi captat\u0103 de lentilele unui microscop \u0219i transformat\u0103 \u00eentr-o imagine real\u0103.<\/p>\n\n\n\n Combina\u021bia dintre fluorescen\u021b\u0103, lentile \u0219i camere ne permite s\u0103 ob\u021binem o imagine a proceselor din interiorul celulelor din mai multe perspective \u0219i aspecte diferite.<\/p>\n\n\n\n De exemplu, cu ajutorul microscopului, avem o vedere mai ampl\u0103 a unei felii de creier de \u0219oarece cu un obiectiv de 2,5x sau 4x \u0219i detalii mici ale citoscheletului de actin\u0103 sondat \u00een aceea\u0219i prob\u0103 cu un obiectiv de 63x.<\/p>\n\n\n\n Pentru a permite aceste teste, putem folosi anticorpi sau coloran\u021bi \u00eempotriva unor proteine specifice prezente \u00een celule sau \u021besuturi, iar anticorpul este de obicei \u00eenso\u021bit de un fluorofor.<\/p>\n\n\n\n Schimbarea lui Stokes explic\u0103 acest fenomen: fluoroforii pierd energie vibra\u021bional\u0103 sub form\u0103 de lumin\u0103 emis\u0103 atunci c\u00e2nd trec de la o stare excitat\u0103 la starea fundamental\u0103. Microscoapele cu fluorescen\u021b\u0103 vor furniza lumina pentru a excita fluoroforul \u0219i vor primi lumina emis\u0103 de acesta. Lumina emis\u0103 poate fi captat\u0103 de o lentil\u0103, procesat\u0103 \u00een interiorul unei camere CCD \u0219i transformat\u0103 \u00eentr-o imagine digital\u0103.<\/p>\n\n\n\n Dar s\u0103 vorbim mai t\u00e2rziu despre achizi\u021bia de imagini celulare. Acum, ar trebui s\u0103 v\u0103 prezent\u0103m exemple \u0219i sfaturi pentru principalii pa\u0219i \u00eenainte de achizi\u021bia imaginii.<\/p>\n\n\n\n Cum alegem \u0219i combin\u0103m diferite tipuri de coloran\u021bi \u0219i anticorpi pentru a vedea \u0219i \u00een\u021belege rela\u021biile dintre organite \u0219i proteine din interiorul celulelor sau \u021besuturilor?<\/p>\n\n\n\n \u00cen primul r\u00e2nd, oamenii de \u0219tiin\u021b\u0103 trebuie s\u0103 stabileasc\u0103 ce anticorpi \u0219i coloran\u021bi s\u0103 foloseasc\u0103 pe baza cercet\u0103rilor lor.<\/p>\n\n\n\n De exemplu, \u00een acest articol<\/a>, Mendon\u00e7a a \u00eencercat s\u0103 evalueze efectele \u0219i riscurile poten\u021biale ale nanoparticulelor de lipide solide cationice (cSLN) la \u0219obolani. Multe nanoparticule sunt dezvoltate \u0219i studiate \u00een fiecare an, cu scopul de a \u00eembun\u0103t\u0103\u021bi livrarea de medicamente sau gene pentru a trata numeroase boli. Una dintre \u00eentreb\u0103rile interesante din acest studiu a fost dac\u0103 nanoparticulele au fost capabile s\u0103 ajung\u0103 la creier prin traversarea barierei hemato-encefalice. Aceast\u0103 barier\u0103 ne protejeaz\u0103 creierul de toxinele sau agen\u021bii patogeni care circul\u0103 \u0219i, de obicei, nu este de dorit ca moleculele s\u0103 traverseze bariera. Dar \u00een acest caz particular, Mendon\u00e7a's<\/a> Scopul a fost ca nanoparticulele s\u0103 traverseze bariera \u0219i s\u0103 ajung\u0103 la creier, pentru a livra medicamente sau gene \u00eentr-o aplica\u021bie viitoare.<\/p>\n\n\n\n Dorind s\u0103 vad\u0103 dac\u0103 nanoparticulele erau prezente \u00een parenchimul cerebral, autorii au folosit un marker al celulelor endoteliale pentru vase numit RECA-1 (reprezentat \u00een ro\u0219u), \u00een timp ce nucleele celulelor au fost colorate cu un colorant numit DAPI (4\u2032,6-diamidino-2-fenilindol), care este albastru. De asemenea, putem observa mici puncte verzi pentru nanoparticulele din afara vaselor, ceea ce \u00eenseamn\u0103 c\u0103 acestea au ajuns \u00een parenchimul cerebral.<\/p>\n\n\n\n Consulta\u021bi infograficul de mai jos cu o imagine de reprezentare.<\/p>\n\n\n S\u0103 \u00een\u021belegem ce face anticorpul pentru RECA-1 (ro\u0219u).<\/p>\n\n\n\n Ace\u0219ti anticorpi sunt concepu\u021bi pentru a servi ca sonde specifice \u0219i vizeaz\u0103 un antigen specific (\u00een cazul nostru, proteina RECA-1).<\/p>\n\n\n\n Acestea pot fi marcate cu un fluorofor sau pot fi recunoscute ulterior de un anticorp secundar legat de un fluorofor.<\/p>\n\n\n\n Prin urmare, dup\u0103 excitarea probei cu o surs\u0103 de lumin\u0103, proteina specific\u0103 pe care o c\u0103uta\u021bi va fi recunoscut\u0103 \u00een proba dumneavoastr\u0103 prin emisia de lumin\u0103 \u00eentr-o anumit\u0103 lungime de und\u0103.<\/a>.<\/p>\n\n\n\n \u00cen cazul DAPI, acest colorant este un contracolorant pentru nuclei \u0219i nucleozomi \u0219i emite fluorescen\u021b\u0103 albastr\u0103 atunci c\u00e2nd se leag\u0103 de regiunile AT ale ADN-ului.<\/p>\n\n\n\n Cum se proiecteaz\u0103 un panel pentru imunofluorescen\u021b\u0103? <\/strong><\/p>\n\n\n\n \u00cencepe\u021bi cu ace\u0219ti pa\u0219i:<\/strong><\/p>\n\n\n\n \u00cen cele din urm\u0103, verifica\u021bi un exemplu pentru un experiment ipotetic \u00een care avem Hoechst 33258 pentru acizii nucleici \u0219i un anticorp primar \u00eempotriva RECA-1 marcat cu un anticorp secundar Alexa Fluor 647.<\/p>\n\n\n\n Ideal ar fi s\u0103 folosim un microscop disponibil cu un cub DAPI (excita\u021bie 377\/50 \u0219i emisie 447\/60) \u0219i un cub CY5 (excita\u021bie 628\/40 \u0219i emisie 685\/40). Toate aceste informa\u021bii le-am inserat la Vizualizator de spectre de fluorescen\u021b\u0103<\/a> \u0219i am ob\u021binut spectrele pentru ambii coloran\u021bi \u0219i l\u0103\u021bimile de band\u0103 pentru ambele cuburi (consulta\u021bi spectrul \u00een infograficul de mai sus).<\/p>\n\n\n\n Acest eseu ipotetic este un bun exemplu \u00een care spectrele fluoroforilor se afl\u0103 \u00een interiorul filtrelor de excita\u021bie \u0219i de emisie, ceea ce permite cercet\u0103torului s\u0103 capteze e\u0219antioanele sale \u00een cel mai bun mod posibil.<\/p>\n\n\n\n Acum, este timpul s\u0103 mergem \u00een laborator \u0219i s\u0103 punem totul \u00een practic\u0103!<\/p>\n\n\n\n Sper ca aceste sfaturi s\u0103 v\u0103 ajute \u00een urm\u0103torul experiment de laborator. Mult noroc!<\/p>\n\n\n\n Referin\u021be:<\/strong><\/p>\n\n\n\n O mare parte din rutina omului de \u0219tiin\u021b\u0103 const\u0103 \u00een conceperea \u0219i efectuarea de experimente. Combina\u021bia de tehnici de laborator va r\u0103spunde la majoritatea \u00eentreb\u0103rilor propuse de oamenii de \u0219tiin\u021b\u0103, iar fluxul de lucru pentru a sugera noi metode depinde de preg\u0103tirea \u0219i experien\u021ba cercet\u0103torului. Pentru biologi, imaginile celulelor pot spune multe despre ceea ce se \u00eent\u00e2mpl\u0103 cu [...]<\/p>","protected":false},"author":18,"featured_media":12982,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[66,959,958,28,38],"tags":[51,554,962],"yoast_head":"\n![\"Infografic](\"https:\/\/mindthegraph.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/preview-347880-7-788x1024.png\")
<\/a><\/figure><\/div>\n\n\n\n
\n