O uso de corantes, anticorpos e sondas fluorescentes permite que os cientistas vejam nas c\u00e9lulas do microsc\u00f3pio imagens do que de outra forma era pequeno demais para ser visto e at\u00e9 mesmo compreendido.<\/p>\n\n\n\n
Microsc\u00f3pios de fluoresc\u00eancia<\/strong> e o uso de fluorocromos tornou-se poss\u00edvel em 19301<\/sup><\/a>e hoje muitas combina\u00e7\u00f5es de fluorocromos s\u00e3o poss\u00edveis para colorir prote\u00ednas, organelas e estruturas dentro das c\u00e9lulas e tecidos.<\/p>\n\n\n\n Fluorocromos (ou fluor\u00f3foros)<\/strong> s\u00e3o mol\u00e9culas que quando excitadas com um comprimento de onda de luz espec\u00edfico, emitem luz de um comprimento de onda definido que ser\u00e1 capturado pelas lentes de um microsc\u00f3pio, e transformado em uma imagem real.<\/p>\n\n\n\n A combina\u00e7\u00e3o de fluoresc\u00eancia, lentes e c\u00e2meras nos permite tirar uma imagem dos processos dentro das c\u00e9lulas em muitas vis\u00f5es e aspectos diferentes.<\/p>\n\n\n\n Por exemplo, usando o microsc\u00f3pio, temos uma vis\u00e3o mais ampla de uma fatia de c\u00e9rebro de rato em uma objetiva de 2,5x ou 4x, e pequenos detalhes do citoesqueleto de a\u00e7\u00e3o sondado na mesma amostra usando uma objetiva de 63x.<\/p>\n\n\n\n Para possibilitar estes ensaios, podemos usar anticorpos ou corantes contra prote\u00ednas espec\u00edficas presentes na c\u00e9lula ou tecido, e o anticorpo geralmente vem com um fluor\u00f3foro.<\/p>\n\n\n\n O deslocamento de Stokes explica este fen\u00f4meno: os fluor\u00f3foros perdem energia vibracional na forma de luz emitida quando mudam de um estado excitado para o estado de terra. Os microsc\u00f3pios de fluoresc\u00eancia fornecem a luz para excitar o fluor\u00f3foro, e recebem sua luz emitida. A luz emitida pode ser capturada por uma lente, processada dentro de uma c\u00e2mera CCD, e transformada em uma imagem digital.<\/p>\n\n\n\n Mas vamos falar sobre a aquisi\u00e7\u00e3o de imagem celular mais tarde. Agora, devemos apresentar-lhe exemplos e dicas para os principais passos antes de adquirir sua imagem.<\/p>\n\n\n\n Como escolher e combinar diferentes tipos de corantes e anticorpos, para ver e entender as rela\u00e7\u00f5es entre organelas e prote\u00ednas dentro das c\u00e9lulas ou tecidos?<\/p>\n\n\n\n Primeiro, os cientistas precisam determinar quais anticorpos e corantes devem ser usados com base em suas pesquisas.<\/p>\n\n\n\n Por exemplo, neste artigo<\/a>Mendon\u00e7a estava tentando avaliar os efeitos e os riscos potenciais das nanopart\u00edculas de lip\u00eddios s\u00f3lidos cati\u00f4nicos (cSLNs) em ratos. Muitas nanopart\u00edculas s\u00e3o desenvolvidas e estudadas a cada ano, com o objetivo de melhorar o fornecimento de medicamentos ou genes para tratar muitas doen\u00e7as. Uma das quest\u00f5es interessantes neste estudo foi se as nanopart\u00edculas eram capazes de alcan\u00e7ar o c\u00e9rebro atravessando a barreira hematoencef\u00e1lica. Esta barreira protege nosso c\u00e9rebro de toxinas ou pat\u00f3genos circulantes e, geralmente, n\u00e3o \u00e9 desej\u00e1vel que as mol\u00e9culas atravessem a barreira. Mas neste caso em particular, Mendon\u00e7a's<\/a> O objetivo era que as nanopart\u00edculas atravessassem a barreira e alcan\u00e7assem o c\u00e9rebro, para entregar drogas ou genes em uma aplica\u00e7\u00e3o futura.<\/p>\n\n\n\n Disposto a ver se as nanopart\u00edculas estavam presentes no par\u00eanquima cerebral, os autores usaram um marcador de c\u00e9lulas endoteliais para os vasos chamado RECA-1 (representado em vermelho), enquanto os n\u00facleos celulares foram corados com um corante chamado DAPI (4\u2032,6-diamidino-2-fenilindole) que \u00e9 azul. Tamb\u00e9m podemos observar pequenos pontos verdes para as nanopart\u00edculas fora dos vasos, o que significa que elas alcan\u00e7aram o par\u00eanquima cerebral.<\/p>\n\n\n\n Confira o infogr\u00e1fico abaixo com uma imagem de representa\u00e7\u00e3o.<\/p>\n\n\n Vamos entender o que o anticorpo para RECA-1 (vermelho) est\u00e1 fazendo.<\/p>\n\n\n\n Estes anticorpos s\u00e3o projetados para servir como sondas espec\u00edficas e visam um ant\u00edgeno espec\u00edfico (em nosso caso, a prote\u00edna RECA-1).<\/p>\n\n\n\n Eles podem ser rotulados com um fluor\u00f3foro ou reconhecidos posteriormente por um anticorpo secund\u00e1rio ligado a um fluor\u00f3foro.<\/p>\n\n\n\n Portanto, depois de excitar a amostra com uma fonte de luz, a prote\u00edna espec\u00edfica que voc\u00ea est\u00e1 procurando ser\u00e1 reconhecida em sua amostra pela emiss\u00e3o de luz em um comprimento de onda espec\u00edfico<\/a>.<\/p>\n\n\n\n No caso do DAPI, este corante \u00e9 n\u00facleos e contra-manchas nucle\u00f3sicas, e emite fluoresc\u00eancia azul quando ligado a regi\u00f5es AT do DNA.<\/p>\n\n\n\n Como projetar um painel para imunofluoresc\u00eancia? <\/strong><\/p>\n\n\n\n Comece com estas etapas:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Finalmente, veja um exemplo de uma experi\u00eancia hipot\u00e9tica onde temos o Hoechst 33258 para os \u00e1cidos nucl\u00e9icos, e um anticorpo prim\u00e1rio contra RECA-1 rotulado com um anticorpo secund\u00e1rio Alexa Fluor 647.<\/p>\n\n\n\n O ideal seria usar um microsc\u00f3pio dispon\u00edvel com um cubo DAPI (excita\u00e7\u00e3o 377\/50 e emiss\u00e3o 447\/60), e um cubo CY5 (excita\u00e7\u00e3o 628\/40 e emiss\u00e3o 685\/40). Todas estas informa\u00e7\u00f5es inserimos em Visualizador de Espectros de Fluoresc\u00eancia<\/a> e obteve os espectros para ambos os corantes, e as larguras de banda para ambos os cubos (verifique o espectro no infogr\u00e1fico acima).<\/p>\n\n\n\n Este ensaio hipot\u00e9tico \u00e9 um bom exemplo onde os espectros dos fluor\u00f3foros pertencem dentro dos filtros de excita\u00e7\u00e3o e emiss\u00e3o, tornando poss\u00edvel ao pesquisador capturar suas amostras da melhor maneira poss\u00edvel.<\/p>\n\n\n\n Agora, \u00e9 hora de ir para o laborat\u00f3rio e colocar tudo em pr\u00e1tica!<\/p>\n\n\n\n Espero que estas dicas o ajudem em sua pr\u00f3xima experi\u00eancia de laborat\u00f3rio. Boa sorte!<\/p>\n\n\n\n Refer\u00eancias:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Uma grande parte da rotina do cientista \u00e9 projetar e realizar experimentos. A combina\u00e7\u00e3o de t\u00e9cnicas de laborat\u00f3rio responder\u00e1 \u00e0 maioria das quest\u00f5es propostas pelos cientistas, e o fluxo de trabalho para sugerir novos m\u00e9todos depende da forma\u00e7\u00e3o e experi\u00eancia do cientista. Para os bi\u00f3logos, as imagens celulares podem dizer muito sobre o que est\u00e1 acontecendo com o [...]<\/p>","protected":false},"author":18,"featured_media":12982,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[66,959,958,28,38],"tags":[51,554,962],"yoast_head":"\n![\"Mind](\"https:\/\/mindthegraph.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/preview-347880-7-788x1024.png\")
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