Zastosowanie barwnik\u00f3w, przeciwcia\u0142 i sond fluorescencyjnych pozwala naukowcom zobaczy\u0107 w kom\u00f3rkach mikroskopowych obrazy tego, co w przeciwnym razie by\u0142oby zbyt ma\u0142e, aby je zobaczy\u0107, a nawet zrozumie\u0107.<\/p>\n\n\n\n
Mikroskopy fluorescencyjne<\/strong> i wykorzystanie fluorochrom\u00f3w sta\u0142o si\u0119 mo\u017cliwe w 1930 roku1<\/sup><\/a>Obecnie mo\u017cliwych jest wiele kombinacji fluorochrom\u00f3w do barwienia bia\u0142ek, organelli i struktur w kom\u00f3rkach i tkankach.<\/p>\n\n\n\n Fluorochromy (lub fluorofory)<\/strong> to cz\u0105steczki, kt\u00f3re po wzbudzeniu \u015bwiat\u0142em o okre\u015blonej d\u0142ugo\u015bci fali emituj\u0105 \u015bwiat\u0142o o okre\u015blonej d\u0142ugo\u015bci fali, kt\u00f3re zostanie przechwycone przez soczewki mikroskopu i przekszta\u0142cone w rzeczywisty obraz.<\/p>\n\n\n\n Po\u0142\u0105czenie fluorescencji, obiektyw\u00f3w i kamer pozwala nam uzyska\u0107 obraz proces\u00f3w zachodz\u0105cych wewn\u0105trz kom\u00f3rek w wielu r\u00f3\u017cnych widokach i aspektach.<\/p>\n\n\n\n Na przyk\u0142ad, korzystaj\u0105c z mikroskopu, mamy szerszy widok wycinka m\u00f3zgu myszy w obiektywie 2,5x lub 4x, a tak\u017ce drobne szczeg\u00f3\u0142y badanego cytoszkieletu aktyny w tej samej pr\u00f3bce przy u\u017cyciu obiektywu 63x.<\/p>\n\n\n\n Aby umo\u017cliwi\u0107 te testy, mo\u017cemy u\u017cy\u0107 przeciwcia\u0142 lub barwnik\u00f3w przeciwko okre\u015blonym bia\u0142kom obecnym w kom\u00f3rce lub tkance, a przeciwcia\u0142o zwykle zawiera fluorofor.<\/p>\n\n\n\n Przesuni\u0119cie Stokesa wyja\u015bnia to zjawisko: fluorofory trac\u0105 energi\u0119 wibracyjn\u0105 w postaci emitowanego \u015bwiat\u0142a, gdy przechodz\u0105 ze stanu wzbudzonego z powrotem do stanu podstawowego. Mikroskopy fluorescencyjne dostarczaj\u0105 \u015bwiat\u0142o do wzbudzenia fluoroforu i odbieraj\u0105 emitowane przez niego \u015bwiat\u0142o. Emitowane \u015bwiat\u0142o mo\u017ce by\u0107 rejestrowane przez obiektyw, przetwarzane w kamerze CCD i przekszta\u0142cane w obraz cyfrowy.<\/p>\n\n\n\n Ale o pozyskiwaniu obraz\u00f3w kom\u00f3rek porozmawiamy p\u00f3\u017aniej. Teraz powinni\u015bmy przedstawi\u0107 przyk\u0142ady i wskaz\u00f3wki dotycz\u0105ce g\u0142\u00f3wnych krok\u00f3w przed pozyskaniem obrazu.<\/p>\n\n\n\n Jak wybieramy i \u0142\u0105czymy r\u00f3\u017cne rodzaje barwnik\u00f3w i przeciwcia\u0142, aby zobaczy\u0107 i zrozumie\u0107 relacje mi\u0119dzy organellami i bia\u0142kami wewn\u0105trz kom\u00f3rek lub tkanek?<\/p>\n\n\n\n Po pierwsze, naukowcy musz\u0105 okre\u015bli\u0107, kt\u00f3re przeciwcia\u0142a i barwniki nale\u017cy zastosowa\u0107 w oparciu o ich badania.<\/p>\n\n\n\n Na przyk\u0142ad, w tym artykule<\/a>Mendon\u00e7a pr\u00f3bowa\u0142 oceni\u0107 skutki i potencjalne zagro\u017cenia zwi\u0105zane z kationowymi sta\u0142ymi nanocz\u0105stkami lipidowymi (cSLN) u szczur\u00f3w. Ka\u017cdego roku opracowywanych i badanych jest wiele nanocz\u0105stek, kt\u00f3rych celem jest zwi\u0119kszenie dostarczania lek\u00f3w lub gen\u00f3w w leczeniu wielu chor\u00f3b. Jednym z interesuj\u0105cych pyta\u0144 w tym badaniu by\u0142o to, czy nanocz\u0105steczki by\u0142y w stanie dotrze\u0107 do m\u00f3zgu, przekraczaj\u0105c barier\u0119 krew-m\u00f3zg. Bariera ta chroni nasz m\u00f3zg przed kr\u0105\u017c\u0105cymi toksynami lub patogenami i zwykle nie jest po\u017c\u0105dane, aby cz\u0105steczki przekracza\u0142y t\u0119 barier\u0119. Ale w tym konkretnym przypadku, Mendon\u00e7a's<\/a> Celem by\u0142o, aby nanocz\u0105steczki przekroczy\u0142y barier\u0119 i dotar\u0142y do m\u00f3zgu, aby dostarczy\u0107 leki lub geny w przysz\u0142ym zastosowaniu.<\/p>\n\n\n\n Chc\u0105c sprawdzi\u0107, czy nanocz\u0105steczki by\u0142y obecne w mi\u0105\u017cszu m\u00f3zgu, autorzy u\u017cyli markera kom\u00f3rek \u015br\u00f3db\u0142onka dla naczy\u0144 o nazwie RECA-1 (reprezentowanego na czerwono), podczas gdy j\u0105dra kom\u00f3rkowe zosta\u0142y zabarwione barwnikiem o nazwie DAPI (4\u2032,6-diamidino-2-fenyloindol), kt\u00f3ry jest niebieski. Mo\u017cemy r\u00f3wnie\u017c zaobserwowa\u0107 ma\u0142e zielone kropki dla nanocz\u0105stek poza naczyniami, co oznacza, \u017ce dotar\u0142y one do mi\u0105\u017cszu m\u00f3zgu.<\/p>\n\n\n\n Sprawd\u017a poni\u017csz\u0105 infografik\u0119 z obrazem reprezentacyjnym.<\/p>\n\n\n Zrozummy, co robi przeciwcia\u0142o dla RECA-1 (czerwone).<\/p>\n\n\n\n Przeciwcia\u0142a te s\u0105 zaprojektowane jako specyficzne sondy i celuj\u0105 w okre\u015blony antygen (w naszym przypadku bia\u0142ko RECA-1).<\/p>\n\n\n\n Mog\u0105 by\u0107 one znakowane fluoroforem lub rozpoznawane p\u00f3\u017aniej przez przeciwcia\u0142o drugorz\u0119dowe po\u0142\u0105czone z fluoroforem.<\/p>\n\n\n\n Dlatego po wzbudzeniu pr\u00f3bki \u017ar\u00f3d\u0142em \u015bwiat\u0142a, konkretne bia\u0142ko, kt\u00f3rego szukasz, zostanie rozpoznane w pr\u00f3bce przez emisj\u0119 \u015bwiat\u0142a o okre\u015blonej d\u0142ugo\u015bci fali.<\/a>.<\/p>\n\n\n\n W przypadku DAPI barwnik ten jest kontrbarwnikiem j\u0105der i nukleosom\u00f3w i emituje niebiesk\u0105 fluorescencj\u0119 po zwi\u0105zaniu z regionami AT DNA.<\/p>\n\n\n\n Jak zaprojektowa\u0107 panel do immunofluorescencji? <\/strong><\/p>\n\n\n\n Zacznij od tych krok\u00f3w:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Na koniec sprawd\u017a przyk\u0142ad hipotetycznego eksperymentu, w kt\u00f3rym mamy Hoechst 33258 dla kwas\u00f3w nukleinowych i pierwszorz\u0119dowe przeciwcia\u0142o przeciwko RECA-1 znakowane drugorz\u0119dowym przeciwcia\u0142em Alexa Fluor 647.<\/p>\n\n\n\n Idealnie by\u0142oby u\u017cy\u0107 mikroskopu dost\u0119pnego z kostk\u0105 DAPI (wzbudzenie 377\/50 i emisja 447\/60) oraz kostk\u0105 CY5 (wzbudzenie 628\/40 i emisja 685\/40). Wszystkie te informacje umie\u015bcili\u015bmy na stronie Przegl\u0105darka widm fluorescencji<\/a> i uzyska\u0142 widma dla obu barwnik\u00f3w oraz szeroko\u015bci pasma dla obu kostek (sprawd\u017a widmo na infografice powy\u017cej).<\/p>\n\n\n\n Ten hipotetyczny esej jest dobrym przyk\u0142adem, w kt\u00f3rym widma fluorofor\u00f3w nale\u017c\u0105 do filtr\u00f3w wzbudzenia i emisji, umo\u017cliwiaj\u0105c badaczowi uchwycenie pr\u00f3bek w najlepszy mo\u017cliwy spos\u00f3b.<\/p>\n\n\n\n Teraz nadszed\u0142 czas, aby uda\u0107 si\u0119 do laboratorium i zastosowa\u0107 wszystko w praktyce!<\/p>\n\n\n\n Mam nadziej\u0119, \u017ce te wskaz\u00f3wki pomog\u0105 ci w nast\u0119pnym eksperymencie laboratoryjnym. Powodzenia!<\/p>\n\n\n\n Referencje:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Du\u017c\u0105 cz\u0119\u015b\u0107 rutyny naukowca stanowi projektowanie i przeprowadzanie eksperyment\u00f3w. Po\u0142\u0105czenie technik laboratoryjnych odpowie na wi\u0119kszo\u015b\u0107 pyta\u0144 zaproponowanych przez naukowc\u00f3w, a przep\u0142yw pracy w celu zaproponowania nowych metod zale\u017cy od do\u015bwiadczenia i do\u015bwiadczenia naukowca. Dla biolog\u00f3w obrazy kom\u00f3rek mog\u0105 wiele powiedzie\u0107 o tym, co dzieje si\u0119 z [...]<\/p>","protected":false},"author":18,"featured_media":12982,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[66,959,958,28,38],"tags":[51,554,962],"yoast_head":"\n![\"Infografika](\"https:\/\/mindthegraph.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/preview-347880-7-788x1024.png\")
<\/a><\/figure><\/div>\n\n\n\n
\n