L'uso di coloranti, anticorpi e sonde fluorescenti permette agli scienziati di vedere nelle cellule del microscopio immagini di ci\u00f2 che altrimenti era troppo piccolo per essere visto e persino compreso.<\/p>\n\n\n\n
Microscopi a fluorescenza<\/strong> e l'uso di fluorocromi \u00e8 diventato possibile nel 19301<\/sup><\/a>Oggi sono possibili molte combinazioni di fluorocromi per colorare proteine, organelli e strutture all'interno di cellule e tessuti.<\/p>\n\n\n\n Fluorocromi (o fluorofori)<\/strong> sono molecole che, se eccitate con una specifica lunghezza d'onda della luce, emettono una luce di una lunghezza d'onda definita che verr\u00e0 catturata dalle lenti di un microscopio e trasformata in un'immagine reale.<\/p>\n\n\n\n La combinazione di fluorescenza, lenti e fotocamere ci permette di scattare un'immagine dei processi all'interno delle cellule in molti punti di vista e aspetti diversi.<\/p>\n\n\n\n Ad esempio, utilizzando il microscopio, possiamo avere una visione pi\u00f9 ampia di una fetta di cervello di topo con un obiettivo 2,5x o 4x, e piccoli dettagli del citoscheletro di actina analizzato nello stesso campione con un obiettivo 63x.<\/p>\n\n\n\n Per consentire questi saggi, possiamo utilizzare anticorpi o coloranti contro proteine specifiche presenti nella cellula o nel tessuto, e l'anticorpo di solito \u00e8 dotato di un fluoroforo.<\/p>\n\n\n\n Lo spostamento di Stokes spiega questo fenomeno: i fluorofori perdono energia vibrazionale sotto forma di luce emessa quando passano da uno stato eccitato allo stato fondamentale. I microscopi a fluorescenza forniscono la luce per eccitare il fluoroforo e ricevono la luce emessa. La luce emessa pu\u00f2 essere catturata da una lente, elaborata da una telecamera CCD e trasformata in un'immagine digitale.<\/p>\n\n\n\n Ma parliamo dell'acquisizione dell'immagine della cella in un secondo momento. Ora \u00e8 opportuno presentare esempi e suggerimenti per le fasi principali che precedono l'acquisizione dell'immagine.<\/p>\n\n\n\n Come scegliamo e combiniamo diversi tipi di coloranti e anticorpi per vedere e capire le relazioni tra organelli e proteine all'interno di cellule o tessuti?<\/p>\n\n\n\n In primo luogo, gli scienziati devono stabilire quali anticorpi e coloranti utilizzare in base alla loro ricerca.<\/p>\n\n\n\n Ad esempio, in questo articolo<\/a>Mendon\u00e7a ha cercato di valutare gli effetti e i potenziali rischi delle nanoparticelle lipidiche solide cationiche (cSLN) nei ratti. Ogni anno vengono sviluppate e studiate molte nanoparticelle, con l'obiettivo di migliorare la somministrazione di farmaci o geni per il trattamento di molte malattie. Una delle domande interessanti di questo studio era se le nanoparticelle fossero in grado di raggiungere il cervello attraversando la barriera emato-encefalica. Questa barriera protegge il nostro cervello dalle tossine o dagli agenti patogeni in circolazione e di solito non \u00e8 auspicabile che le molecole attraversino la barriera. Ma in questo caso particolare, Mendon\u00e7a<\/a> L'obiettivo era che le nanoparticelle attraversassero la barriera e raggiungessero il cervello, per veicolare farmaci o geni in un'applicazione futura.<\/p>\n\n\n\n Per verificare se le nanoparticelle fossero presenti nel parenchima cerebrale, gli autori hanno utilizzato un marcatore di cellule endoteliali per i vasi chiamato RECA-1 (rappresentato in rosso), mentre i nuclei delle cellule sono stati colorati con un colorante chiamato DAPI (4\u2032,6-diamidino-2-fenilindolo) che \u00e8 blu. Si possono anche osservare piccoli punti verdi per le nanoparticelle al di fuori dei vasi, il che significa che hanno raggiunto il parenchima cerebrale.<\/p>\n\n\n\n Guardate l'infografica qui sotto con un'immagine di rappresentazione.<\/p>\n\n\n Cerchiamo di capire cosa fa l'anticorpo per RECA-1 (rosso).<\/p>\n\n\n\n Questi anticorpi sono progettati per fungere da sonde specifiche e mirano a un antigene specifico (nel nostro caso, la proteina RECA-1).<\/p>\n\n\n\n Possono essere marcati con un fluoroforo o riconosciuti successivamente da un anticorpo secondario legato a un fluoroforo.<\/p>\n\n\n\n Pertanto, dopo aver eccitato il campione con una sorgente luminosa, la proteina specifica che si sta cercando sar\u00e0 riconosciuta nel campione grazie all'emissione di luce in una specifica lunghezza d'onda<\/a>.<\/p>\n\n\n\n Nel caso del DAPI, questo colorante \u00e8 un colorante di contrasto dei nuclei e dei nucleosomi ed emette una fluorescenza blu quando si lega alle regioni AT del DNA.<\/p>\n\n\n\n Come progettare un pannello per l'immunofluorescenza? <\/strong><\/p>\n\n\n\n Iniziate con questi passaggi:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Infine, \u00e8 possibile verificare un esempio per un ipotetico esperimento in cui abbiamo Hoechst 33258 per gli acidi nucleici e un anticorpo primario contro RECA-1 marcato con un anticorpo secondario Alexa Fluor 647.<\/p>\n\n\n\n L'ideale sarebbe utilizzare un microscopio con un cubo DAPI (eccitazione 377\/50 ed emissione 447\/60) e un cubo CY5 (eccitazione 628\/40 ed emissione 685\/40). Tutte queste informazioni sono state inserite in Visualizzatore di spettri di fluorescenza<\/a> e abbiamo ottenuto gli spettri di entrambi i coloranti e le larghezze di banda di entrambi i cubi (guardate lo spettro nell'infografica qui sopra).<\/p>\n\n\n\n Questo ipotetico saggio \u00e8 un buon esempio in cui gli spettri dei fluorofori appartengono ai filtri di eccitazione e di emissione, rendendo possibile al ricercatore di catturare i suoi campioni nel modo migliore.<\/p>\n\n\n\n Ora \u00e8 il momento di andare in laboratorio e mettere tutto in pratica!<\/p>\n\n\n\n Spero che questi suggerimenti vi aiutino nel vostro prossimo esperimento di laboratorio. Buona fortuna!<\/p>\n\n\n\n Riferimenti:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Gran parte della routine dello scienziato consiste nel progettare ed eseguire esperimenti. La combinazione di tecniche di laboratorio risponde alla maggior parte delle domande proposte dagli scienziati e il flusso di lavoro per suggerire nuovi metodi dipende dal background e dall'esperienza dello scienziato. Per i biologi, le immagini delle cellule possono dire molto su ci\u00f2 che sta accadendo [...]<\/p>","protected":false},"author":18,"featured_media":12982,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[66,959,958,28,38],"tags":[51,554,962],"yoast_head":"\n![\"Mind](\"https:\/\/mindthegraph.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/preview-347880-7-788x1024.png\")
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