L'utilisation de colorants, d'anticorps et de sondes fluorescentes permet aux scientifiques de voir dans les cellules du microscope des images de ce qui \u00e9tait autrement trop petit pour \u00eatre vu et m\u00eame compris.<\/p>\n\n\n\n
Microscopes \u00e0 fluorescence<\/strong> et l'utilisation de fluorochromes est devenu possible en 19301<\/sup><\/a>Aujourd'hui, de nombreuses combinaisons de fluorochromes sont possibles pour colorer les prot\u00e9ines, les organites et les structures des cellules et des tissus.<\/p>\n\n\n\n Fluorochromes (ou fluorophores)<\/strong> sont des mol\u00e9cules qui, lorsqu'elles sont excit\u00e9es par une longueur d'onde sp\u00e9cifique, \u00e9mettent une lumi\u00e8re d'une longueur d'onde d\u00e9finie qui sera capt\u00e9e par les lentilles d'un microscope et transform\u00e9e en une image r\u00e9elle.<\/p>\n\n\n\n La combinaison de la fluorescence, des lentilles et des cam\u00e9ras nous permet de prendre une image des processus \u00e0 l'int\u00e9rieur des cellules sous de nombreux angles et aspects diff\u00e9rents.<\/p>\n\n\n\n Par exemple, en utilisant le microscope, nous avons une vue plus large d'une tranche de cerveau de souris avec un objectif 2,5x ou 4x, et de petits d\u00e9tails du cytosquelette d'actine sond\u00e9 dans le m\u00eame \u00e9chantillon avec un objectif 63x.<\/p>\n\n\n\n Pour permettre ces analyses, nous pouvons utiliser des anticorps ou des colorants contre des prot\u00e9ines sp\u00e9cifiques pr\u00e9sentes dans la cellule ou le tissu, et l'anticorps est g\u00e9n\u00e9ralement accompagn\u00e9 d'un fluorophore.<\/p>\n\n\n\n Le d\u00e9placement de Stokes explique ce ph\u00e9nom\u00e8ne : les fluorophores perdent de l'\u00e9nergie vibratoire sous forme de lumi\u00e8re \u00e9mise lorsqu'ils passent d'un \u00e9tat excit\u00e9 \u00e0 l'\u00e9tat fondamental. Les microscopes \u00e0 fluorescence fournissent la lumi\u00e8re pour exciter le fluorophore et re\u00e7oivent la lumi\u00e8re \u00e9mise. La lumi\u00e8re \u00e9mise peut \u00eatre captur\u00e9e par une lentille, trait\u00e9e dans une cam\u00e9ra CCD et transform\u00e9e en image num\u00e9rique.<\/p>\n\n\n\n Mais nous parlerons de l'acquisition d'images de cellules plus tard. Maintenant, nous devrions vous pr\u00e9senter des exemples et des conseils pour les principales \u00e9tapes avant l'acquisition de votre image.<\/p>\n\n\n\n Comment choisir et combiner diff\u00e9rents types de colorants et d'anticorps, pour voir et comprendre les relations entre les organelles et les prot\u00e9ines \u00e0 l'int\u00e9rieur des cellules ou des tissus ?<\/p>\n\n\n\n Tout d'abord, les scientifiques doivent d\u00e9terminer les anticorps et les colorants \u00e0 utiliser en fonction de leurs recherches.<\/p>\n\n\n\n Par exemple, dans cet article<\/a>Dans le cadre d'un projet de recherche, Mendon\u00e7a a tent\u00e9 d'\u00e9valuer les effets et les risques potentiels des nanoparticules lipidiques solides cationiques (NPFSc) chez le rat. De nombreuses nanoparticules sont d\u00e9velopp\u00e9es et \u00e9tudi\u00e9es chaque ann\u00e9e, dans le but d'am\u00e9liorer l'administration de m\u00e9dicaments ou de g\u00e8nes pour traiter de nombreuses maladies. L'une des questions int\u00e9ressantes de cette \u00e9tude \u00e9tait de savoir si les nanoparticules \u00e9taient capables d'atteindre le cerveau en traversant la barri\u00e8re h\u00e9mato-enc\u00e9phalique. Cette barri\u00e8re prot\u00e8ge notre cerveau des toxines ou des agents pathog\u00e8nes en circulation et, en g\u00e9n\u00e9ral, il n'est pas souhaitable que des mol\u00e9cules traversent cette barri\u00e8re. Mais dans ce cas particulier, Mendon\u00e7a<\/a> L'objectif \u00e9tait que les nanoparticules traversent la barri\u00e8re et atteignent le cerveau, afin de d\u00e9livrer des m\u00e9dicaments ou des g\u00e8nes dans une application future.<\/p>\n\n\n\n Voulant voir si les nanoparticules \u00e9taient pr\u00e9sentes dans le parenchyme c\u00e9r\u00e9bral, les auteurs ont utilis\u00e9 un marqueur de cellules endoth\u00e9liales pour les vaisseaux appel\u00e9 RECA-1 (repr\u00e9sent\u00e9 en rouge), tandis que les noyaux des cellules ont \u00e9t\u00e9 color\u00e9s avec un colorant appel\u00e9 DAPI (4\u2032,6-diamidino-2-phenylindole) qui est bleu. Nous pouvons \u00e9galement observer des petits points verts pour les nanoparticules \u00e0 l'ext\u00e9rieur des vaisseaux, ce qui signifie qu'elles ont atteint le parenchyme c\u00e9r\u00e9bral.<\/p>\n\n\n\n Consultez l'infographie ci-dessous avec une image de repr\u00e9sentation.<\/p>\n\n\n Comprenons ce que fait l'anticorps pour RECA-1 (rouge).<\/p>\n\n\n\n Ces anticorps sont con\u00e7us pour servir de sondes sp\u00e9cifiques, et ils ciblent un antig\u00e8ne sp\u00e9cifique (dans notre cas, la prot\u00e9ine RECA-1).<\/p>\n\n\n\n Ils peuvent \u00eatre marqu\u00e9s par un fluorophore ou reconnus ult\u00e9rieurement par un anticorps secondaire li\u00e9 \u00e0 un fluorophore.<\/p>\n\n\n\n Par cons\u00e9quent, apr\u00e8s avoir excit\u00e9 l'\u00e9chantillon avec une source de lumi\u00e8re, la prot\u00e9ine sp\u00e9cifique que vous recherchez sera reconnue dans votre \u00e9chantillon par l'\u00e9mission de lumi\u00e8re dans une longueur d'onde sp\u00e9cifique.<\/a>.<\/p>\n\n\n\n Dans le cas du DAPI, ce colorant est la contre-coloration des noyaux et des nucl\u00e9osomes, et il \u00e9met une fluorescence bleue lorsqu'il se lie aux r\u00e9gions AT de l'ADN.<\/p>\n\n\n\n Comment concevoir un panel pour l'immunofluorescence ? <\/strong><\/p>\n\n\n\n Commencez par ces \u00e9tapes :<\/strong><\/p>\n\n\n\n Enfin, v\u00e9rifiez un exemple pour une exp\u00e9rience hypoth\u00e9tique o\u00f9 nous avons du Hoechst 33258 pour les acides nucl\u00e9iques, et un anticorps primaire contre RECA-1 marqu\u00e9 avec un anticorps secondaire Alexa Fluor 647.<\/p>\n\n\n\n Id\u00e9alement, nous utiliserions un microscope disponible avec un cube de DAPI (excitation 377\/50 et \u00e9mission 447\/60), et un cube de CY5 (excitation 628\/40 et \u00e9mission 685\/40). Toutes ces informations, nous les avons ins\u00e9r\u00e9es \u00e0 Visualiseur de spectres de fluorescence<\/a> et obtenu les spectres des deux colorants, ainsi que les largeurs de bande des deux cubes (voir le spectre dans l'infographie ci-dessus).<\/p>\n\n\n\n Cet essai hypoth\u00e9tique est un bon exemple o\u00f9 les spectres des fluorophores se trouvent \u00e0 l'int\u00e9rieur des filtres d'excitation et d'\u00e9mission, ce qui permet au chercheur de capturer ses \u00e9chantillons de la meilleure fa\u00e7on possible.<\/p>\n\n\n\n Maintenant, il est temps d'aller au laboratoire et de mettre tout en pratique !<\/p>\n\n\n\n J'esp\u00e8re que ces conseils vous aideront lors de votre prochaine exp\u00e9rience de laboratoire. Bonne chance !<\/p>\n\n\n\n R\u00e9f\u00e9rences :<\/strong><\/p>\n\n\n\n Une grande partie de la routine du scientifique consiste \u00e0 concevoir et \u00e0 r\u00e9aliser des exp\u00e9riences. La combinaison des techniques de laboratoire r\u00e9pondra \u00e0 la plupart des questions propos\u00e9es par les scientifiques. La capacit\u00e9 \u00e0 proposer de nouvelles m\u00e9thodes d\u00e9pend de la formation et de l'exp\u00e9rience du scientifique. Pour les biologistes, les images de cellules peuvent en dire long sur ce qui se passe dans la [...]<\/p>","protected":false},"author":18,"featured_media":12982,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[66,959,958,28,38],"tags":[51,554,962],"yoast_head":"\n![\"Infographie](\"https:\/\/mindthegraph.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/preview-347880-7-788x1024.png\")
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