V\u00e4riaineiden, vasta-aineiden ja fluoresoivien koettimien k\u00e4yt\u00f6n ansiosta tutkijat voivat n\u00e4hd\u00e4 mikroskoopin soluissa kuvia siit\u00e4, mik\u00e4 muuten olisi liian pient\u00e4 n\u00e4ht\u00e4v\u00e4ksi ja jopa ymm\u00e4rrett\u00e4v\u00e4ksi.<\/p>\n\n\n\n
Fluoresenssimikroskoopit<\/strong> ja fluorokromien k\u00e4ytt\u00f6 tuli mahdolliseksi vuonna 19301<\/sup><\/a>, ja nyky\u00e4\u00e4n on mahdollista v\u00e4rj\u00e4t\u00e4 proteiineja, organelleja sek\u00e4 solujen ja kudosten rakenteita monilla fluorokromiyhdistelmill\u00e4.<\/p>\n\n\n\n Fluorokromit (tai fluorofoorit)<\/strong> ovat molekyylej\u00e4, jotka tietyll\u00e4 valon aallonpituudella her\u00e4tett\u00e4ess\u00e4 s\u00e4teilev\u00e4t tietyn aallonpituuden valoa, jonka mikroskoopin linssit vangitsevat ja muuttavat varsinaiseksi kuvaksi.<\/p>\n\n\n\n Fluoresenssin, objektiivien ja kameroiden yhdistelm\u00e4 mahdollistaa kuvan ottamisen solujen sis\u00e4isist\u00e4 prosesseista monista eri n\u00e4kymist\u00e4 ja n\u00e4k\u00f6kulmista.<\/p>\n\n\n\n Esimerkiksi mikroskoopin avulla voimme tarkastella hiiren aivoviipaletta laajemmin 2,5x- tai 4x-objektiivilla ja tutkia samasta n\u00e4ytteest\u00e4 aktiinisytoskeletin pieni\u00e4 yksityiskohtia 63x-objektiivilla.<\/p>\n\n\n\n N\u00e4iden m\u00e4\u00e4ritysten mahdollistamiseksi voimme k\u00e4ytt\u00e4\u00e4 vasta-aineita tai v\u00e4riaineita tiettyj\u00e4 solussa tai kudoksessa olevia proteiineja vastaan, ja vasta-aineessa on yleens\u00e4 fluorofori.<\/p>\n\n\n\n Stokesin siirtym\u00e4 selitt\u00e4\u00e4 t\u00e4m\u00e4n ilmi\u00f6n: fluorofoorit menett\u00e4v\u00e4t v\u00e4r\u00e4htelyenergiaa emittoituvan valon muodossa, kun ne siirtyv\u00e4t kiihdytetyst\u00e4 tilasta takaisin perustilaan. Fluoresenssimikroskoopit tuottavat valoa fluoroforin her\u00e4tt\u00e4miseksi ja vastaanottavat sen emittoiman valon. Emittoitunut valo voidaan vangita linssill\u00e4, k\u00e4sitell\u00e4 CCD-kamerassa ja muuntaa digitaaliseksi kuvaksi.<\/p>\n\n\n\n Mutta puhutaan solukuvien ottamisesta my\u00f6hemmin. Nyt meid\u00e4n pit\u00e4isi esitell\u00e4 esimerkkej\u00e4 ja vinkkej\u00e4 t\u00e4rkeimmist\u00e4 vaiheista ennen kuvan ottamista.<\/p>\n\n\n\n Miten valitsemme ja yhdistelemme erityyppisi\u00e4 v\u00e4riaineita ja vasta-aineita, jotta voimme n\u00e4hd\u00e4 ja ymm\u00e4rt\u00e4\u00e4 solujen tai kudosten sis\u00e4ll\u00e4 olevien organellien ja proteiinien v\u00e4lisi\u00e4 suhteita?<\/p>\n\n\n\n Tutkijoiden on ensin m\u00e4\u00e4ritett\u00e4v\u00e4, mit\u00e4 vasta-aineita ja v\u00e4riaineita he k\u00e4ytt\u00e4v\u00e4t tutkimuksensa perusteella.<\/p>\n\n\n\n Esimerkiksi, t\u00e4ss\u00e4 artikkelissa<\/a>, Mendon\u00e7a yritti arvioida kationisten kiinteiden lipidin nanohiukkasten (cSLN) vaikutuksia ja mahdollisia riskej\u00e4 rotilla. Joka vuosi kehitet\u00e4\u00e4n ja tutkitaan monia nanohiukkasia, joilla pyrit\u00e4\u00e4n tehostamaan l\u00e4\u00e4kkeiden tai geenien kuljettamista monien sairauksien hoitoon. Yksi t\u00e4m\u00e4n tutkimuksen mielenkiintoisista kysymyksist\u00e4 oli, pystyiv\u00e4tk\u00f6 nanohiukkaset p\u00e4\u00e4sem\u00e4\u00e4n aivoihin ylitt\u00e4m\u00e4ll\u00e4 veri-aivoesteen. T\u00e4m\u00e4 este suojaa aivojamme kiert\u00e4vilt\u00e4 myrkyilt\u00e4 tai taudinaiheuttajilta, ja yleens\u00e4 ei ole toivottavaa, ett\u00e4 molekyylit ylitt\u00e4v\u00e4t esteen. Mutta t\u00e4ss\u00e4 erityistapauksessa Mendon\u00e7an<\/a> Tavoitteena oli, ett\u00e4 nanohiukkaset ylitt\u00e4isiv\u00e4t esteen ja p\u00e4\u00e4sisiv\u00e4t aivoihin, jotta ne voisivat tulevaisuudessa toimittaa l\u00e4\u00e4kkeit\u00e4 tai geenej\u00e4.<\/p>\n\n\n\n Halutessaan n\u00e4hd\u00e4, onko nanohiukkasia l\u00e4sn\u00e4 aivojen parenkyymiss\u00e4, kirjoittajat k\u00e4yttiv\u00e4t verisuonten endoteelisolujen merkkiainetta RECA-1:t\u00e4 (punainen v\u00e4ri), kun taas solujen tumat v\u00e4rj\u00e4ttiin DAPI-v\u00e4riaineella (4\u2032,6-diamidino-2-fenylindoli), joka on sininen. Voimme my\u00f6s havaita pieni\u00e4 vihreit\u00e4 pisteit\u00e4 nanohiukkasista verisuonten ulkopuolella, mik\u00e4 tarkoittaa, ett\u00e4 ne ovat p\u00e4\u00e4sseet aivojen parenkyymiin.<\/p>\n\n\n\n Tutustu alla olevaan infografiikkaan, jossa on esittelykuva.<\/p>\n\n\n Ymm\u00e4rret\u00e4\u00e4n, mit\u00e4 RECA-1-vasta-aine (punainen) tekee.<\/p>\n\n\n\n N\u00e4m\u00e4 vasta-aineet on suunniteltu toimimaan spesifisin\u00e4 koettimina, ja ne kohdistuvat tiettyyn antigeeniin (meid\u00e4n tapauksessamme RECA-1-proteiiniin).<\/p>\n\n\n\n Ne voidaan merkit\u00e4 fluorofoorilla tai tunnistaa my\u00f6hemmin fluorofooriin yhdistetyll\u00e4 sekund\u00e4\u00e4risell\u00e4 vasta-aineella.<\/p>\n\n\n\n Sen j\u00e4lkeen, kun n\u00e4ytett\u00e4 on j\u00e4nnitetty valonl\u00e4hteell\u00e4, Etsim\u00e4si proteiini tunnistetaan n\u00e4ytteess\u00e4si valon emittoimisesta tietyll\u00e4 aallonpituudella.<\/a>.<\/p>\n\n\n\n DAPI:n tapauksessa t\u00e4m\u00e4 v\u00e4riaine on tuman ja nukleosomien vastav\u00e4ri, ja se s\u00e4teilee sinist\u00e4 fluoresenssia sitoutuessaan DNA:n AT-alueisiin.<\/p>\n\n\n\n Miten suunnitella paneeli immunofluoresenssia varten? <\/strong><\/p>\n\n\n\n Aloita n\u00e4ist\u00e4 vaiheista:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Tarkista lopuksi esimerkki hypoteettisesta kokeesta, jossa meill\u00e4 on Hoechst 33258 nukleiinihappoja varten ja ensisijainen vasta-aine RECA-1:t\u00e4 vastaan, joka on merkitty toissijaisella vasta-aineella Alexa Fluor 647.<\/p>\n\n\n\n Ihannetapauksessa k\u00e4yt\u00e4mme mikroskooppia, jossa on DAPI-kuutio (her\u00e4te 377\/50 ja emissio 447\/60) ja CY5-kuutio (her\u00e4te 628\/40 ja emissio 685\/40). Kaikki n\u00e4m\u00e4 tiedot asetamme osoitteeseen Fluoresenssispektrien katseluohjelma<\/a> ja saimme spektrit molemmille v\u00e4riaineille sek\u00e4 kaistanleveydet molemmille kuutioille (katso spektri yll\u00e4 olevasta infograafista).<\/p>\n\n\n\n T\u00e4m\u00e4 hypoteettinen essee on hyv\u00e4 esimerkki, jossa fluorofoorien spektrit kuuluvat her\u00e4te- ja emissiosuodattimien sis\u00e4lle, jolloin tutkija voi tallentaa n\u00e4ytteens\u00e4 parhaalla mahdollisella tavalla.<\/p>\n\n\n\n Nyt on aika menn\u00e4 laboratorioon ja panna kaikki k\u00e4yt\u00e4nt\u00f6\u00f6n!<\/p>\n\n\n\n Toivottavasti n\u00e4ist\u00e4 vinkeist\u00e4 on apua seuraavassa laboratoriokokeessasi. Onnea matkaan!<\/p>\n\n\n\n Viitteet:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Suuri osa tiedemiehen rutiinista on kokeiden suunnittelu ja suorittaminen. Laboratoriotekniikoiden yhdistelm\u00e4ll\u00e4 vastataan useimpiin tutkijoiden esitt\u00e4miin kysymyksiin, ja ty\u00f6nkulku uusien menetelmien ehdottamiseen riippuu tutkijan taustasta ja kokemuksesta. Biologeille solukuvat voivat kertoa paljon siit\u00e4, mit\u00e4 tapahtuu [...].<\/p>","protected":false},"author":18,"featured_media":12982,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[66,959,958,28,38],"tags":[51,554,962],"yoast_head":"\n![\"Mind](\"https:\/\/mindthegraph.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/preview-347880-7-788x1024.png\")
<\/a><\/figure><\/div>\n\n\n\n
\n