V\u00e4rvainete, antikehade ja fluorestseeruvate proovide kasutamine v\u00f5imaldab teadlastel n\u00e4ha mikroskoobi rakkudes pilte sellest, mis muidu oleks liiga v\u00e4ike, et seda n\u00e4ha ja isegi m\u00f5ista.<\/p>\n\n\n\n
Fluorestsentsmikroskoobid<\/strong> ja fluorokroomide kasutamine sai v\u00f5imalikuks 1930. aastal1<\/sup><\/a>ning t\u00e4nap\u00e4eval on v\u00f5imalik kasutada mitmeid fluorokroomide kombinatsioone valkude, organellide ja struktuuride v\u00e4rvimiseks rakkudes ja kudedes.<\/p>\n\n\n\n fluorokroomid (v\u00f5i fluorofoorid)<\/strong> on molekulid, mis konkreetse lainepikkusega valguse ergastamisel kiirgavad kindla lainepikkusega valgust, mida mikroskoobi l\u00e4\u00e4tsed p\u00fc\u00fcavad ja muundavad tegelikuks pildiks.<\/p>\n\n\n\n Fluorestsentsi, objektiivide ja kaamerate kombinatsioon v\u00f5imaldab meil pildistada rakkude sisemisi protsesse mitmest erinevast vaatepunktist ja aspektist.<\/p>\n\n\n\n N\u00e4iteks on meil mikroskoobi abil v\u00f5imalik n\u00e4ha hiire aju viilu laiemalt 2,5x v\u00f5i 4x objektiiviga ning 63x objektiivi kasutades sama proovi aktiints\u00fctoskeleti v\u00e4ikseid detaile.<\/p>\n\n\n\n Selliste anal\u00fc\u00fcside tegemiseks saame kasutada antikehi v\u00f5i v\u00e4rvaineid rakus v\u00f5i koes olevate spetsiifiliste valkude vastu, kusjuures antikeha on tavaliselt varustatud fluorofooriga.<\/p>\n\n\n\n Stokesi nihe seletab seda n\u00e4htust: fluorofoorid kaotavad vibratsioonienergiat kiiratava valguse kujul, kui nad muutuvad ergastatud olekust tagasi p\u00f5hiseisundisse. Fluorestsentsmikroskoobid annavad valguse fluorofoori ergutamiseks ja v\u00f5tavad vastu selle emiteeritud valgust. V\u00e4lja kiiratud valgust saab objektiiviga kinni p\u00fc\u00fcda, t\u00f6\u00f6delda CCD-kaameras ja muuta see digitaalseks pildiks.<\/p>\n\n\n\n Aga r\u00e4\u00e4gime rakupildi hankimisest hiljem. N\u00fc\u00fcd peaksime tutvustama teile n\u00e4iteid ja n\u00e4pun\u00e4iteid peamiste sammude kohta enne pildi omandamist.<\/p>\n\n\n\n Kuidas me valime ja kombineerime erinevaid v\u00e4rvaineid ja antikehi, et n\u00e4ha ja m\u00f5ista rakkude v\u00f5i kudede organellide ja valkude vahelisi seoseid?<\/p>\n\n\n\n K\u00f5igepealt peavad teadlased kindlaks m\u00e4\u00e4rama, milliseid antikehi ja v\u00e4rvaineid nad oma uuringute p\u00f5hjal kasutavad.<\/p>\n\n\n\n N\u00e4iteks, k\u00e4esolevas artiklis<\/a>, p\u00fc\u00fcdis Mendon\u00e7a hinnata katioonsete tahkete lipiidide nanoosakeste (cSLN) m\u00f5ju ja v\u00f5imalikke riske rottidel. Igal aastal t\u00f6\u00f6tatakse v\u00e4lja ja uuritakse palju nanoosakesi, mille eesm\u00e4rk on parandada ravimite v\u00f5i geenide manustamist paljude haiguste raviks. \u00dcks huvitav k\u00fcsimus selles uuringus oli, kas nanoosakesed suudavad j\u00f5uda ajju, \u00fcletades vere-aju barj\u00e4\u00e4ri. See barj\u00e4\u00e4r kaitseb meie aju tsirkuleerivate toksiinide v\u00f5i haigustekitajate eest ning tavaliselt ei ole soovitav, et molekulid seda barj\u00e4\u00e4ri \u00fcletavad. Kuid sel konkreetsel juhul, Mendon\u00e7a's<\/a> eesm\u00e4rk oli, et nanoosakesed \u00fcletaksid barj\u00e4\u00e4ri ja j\u00f5uaksid ajju, et tulevikus saaks neid kasutada ravimite v\u00f5i geenide manustamiseks.<\/p>\n\n\n\n Soovides n\u00e4ha, kas nanoosakesed on olemas ajuparen\u0161\u00fc\u00fcmis, kasutasid autorid endoteelirakkude markerit RECA-1 (kujutatud punasena), samas kui rakutuuma v\u00e4rviti v\u00e4rviga DAPI (4\u2032,6-diamidino-2-fenilindool), mis on sinine. Me v\u00f5ime t\u00e4heldada ka v\u00e4ikeseid rohelisi punkte nanoosakeste kohta v\u00e4ljaspool veresooni, mis t\u00e4hendab, et nad j\u00f5udsid ajuparen\u0161\u00fc\u00fcmi.<\/p>\n\n\n\n Vaadake allolevat infograafikat koos representatsioonipildiga.<\/p>\n\n\n M\u00f5istame, mida teeb RECA-1 antikeha (punane).<\/p>\n\n\n\n Need antikehad on m\u00f5eldud spetsiifiliste proovide jaoks ja need on suunatud spetsiifilisele antigeenile (meie puhul valk RECA-1).<\/p>\n\n\n\n Neid v\u00f5ib m\u00e4rgistada fluorofooriga v\u00f5i hiljem \u00e4ra tunda fluorofooriga seotud sekundaarse antikeha abil.<\/p>\n\n\n\n Seega, p\u00e4rast proovi ergutamist valgusallikaga, konkreetne valk, mida te otsite, tuvastatakse teie proovis valguse erilise lainepikkuse emissiooni j\u00e4rgi.<\/a>.<\/p>\n\n\n\n DAPI puhul on see v\u00e4rvaine tuumade ja nukleosoomide kontrastv\u00e4rv ning see kiirgab sinist fluorestsentsi, kui see seondub DNA AT-piirkondadega.<\/p>\n\n\n\n Kuidas kujundada immunofluorestsentsuse paneel? <\/strong><\/p>\n\n\n\n Alustage neist sammudest:<\/strong><\/p>\n\n\n\n L\u00f5puks vaadake n\u00e4ide h\u00fcpoteetilise katse kohta, kus meil on Hoechst 33258 nukleiinhapete jaoks ja esmane antikeha RECA-1 vastu, mis on m\u00e4rgistatud sekundaarse antikehaga Alexa Fluor 647.<\/p>\n\n\n\n Ideaalis kasutaksime mikroskoopi, millel on DAPI kuubik (ergutus 377\/50 ja emissioon 447\/60) ja CY5 kuubik (ergutus 628\/40 ja emissioon 685\/40). Kogu selle teabe sisestame aadressil Fluorestsentsi spektri vaataja<\/a> ja saime m\u00f5lema v\u00e4rvaine spektrid ning m\u00f5lema kuubiku ribalaiused (vaadake spektrit \u00fclalpool olevas infograafikas).<\/p>\n\n\n\n See h\u00fcpoteetiline essee on hea n\u00e4ide, kus fluorofooride spektrid kuuluvad ergutus- ja emissioonifiltrite sisse, mis v\u00f5imaldab uurijal oma proove parimal v\u00f5imalikul viisil j\u00e4\u00e4dvustada.<\/p>\n\n\n\n N\u00fc\u00fcd on aeg minna laborisse ja panna k\u00f5ik praktikasse!<\/p>\n\n\n\n Loodan, et need n\u00f5uanded aitavad teid teie j\u00e4rgmises laborikatses. Palju \u00f5nne!<\/p>\n\n\n\n Viited:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Suur osa teadlase rutiinist on katsete kavandamine ja l\u00e4biviimine. Laboritehnikate kombinatsioon annab vastuse enamikule teadlaste esitatud k\u00fcsimustele ning uute meetodite v\u00e4ljapakkumise t\u00f6\u00f6voog s\u00f5ltub teadlase taustast ja kogemustest. Bioloogide jaoks v\u00f5ivad rakupildid \u00f6elda palju selle kohta, mis toimub [...]<\/p>","protected":false},"author":18,"featured_media":12982,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[66,959,958,28,38],"tags":[51,554,962],"yoast_head":"\n![\"Mind](\"https:\/\/mindthegraph.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/preview-347880-7-788x1024.png\")
<\/a><\/figure><\/div>\n\n\n\n
\n