Brugen af farvestoffer, antistoffer og fluorescerende prober g\u00f8r det muligt for forskere at se billeder i mikroskopcellerne af det, der ellers var for sm\u00e5t til at blive set og endda forst\u00e5et.<\/p>\n\n\n\n
Fluorescens-mikroskoper<\/strong> og brugen af fluorokromer blev muligt i 19301<\/sup><\/a>og i dag er det muligt at anvende mange kombinationer af fluorokromer til farvning af proteiner, organeller og strukturer i celler og v\u00e6v.<\/p>\n\n\n\n Fluorokromer (eller fluoroforer)<\/strong> er molekyler, der, n\u00e5r de exciteres med en bestemt b\u00f8lgel\u00e6ngde af lys, udsender lys med en defineret b\u00f8lgel\u00e6ngde, som indfanges af linserne i et mikroskop og omdannes til et faktisk billede.<\/p>\n\n\n\n Kombinationen af fluorescens, linser og kameraer g\u00f8r det muligt for os at tage et billede af processer inde i celler fra mange forskellige vinkler og aspekter.<\/p>\n\n\n\n Ved hj\u00e6lp af mikroskopet har vi for eksempel et bredere overblik over en skive af en musehjerne i et 2,5x eller 4x objektiv, og sm\u00e5 detaljer om det unders\u00f8gte aktincytoskelet i den samme pr\u00f8ve ved hj\u00e6lp af et 63x objektiv.<\/p>\n\n\n\n For at muligg\u00f8re disse assays kan vi bruge antistoffer eller farvestoffer mod specifikke proteiner, der findes i cellen eller v\u00e6vet, og antistoffet leveres normalt med en fluorofor.<\/p>\n\n\n\n Stokes' skift forklarer dette f\u00e6nomen: Fluoroforer mister vibrationsenergi i form af udsendt lys, n\u00e5r de skifter fra en exciteret tilstand tilbage til grundtilstanden. Fluorescensmikroskoper leverer lyset til at excitere fluoroforen og modtager dens udsendte lys. Det udsendte lys kan opfanges af en linse, behandles i et CCD-kamera og omdannes til et digitalt billede.<\/p>\n\n\n\n Men lad os tale om optagelse af cellebilleder senere. Nu skal vi pr\u00e6sentere dig for eksempler og tips til de vigtigste trin, f\u00f8r du optager dit billede.<\/p>\n\n\n\n Hvordan v\u00e6lger og kombinerer vi forskellige typer farvestoffer og antistoffer for at se og forst\u00e5 forholdet mellem organeller og proteiner inde i celler eller v\u00e6v?<\/p>\n\n\n\n F\u00f8rst skal forskerne afg\u00f8re, hvilke antistoffer og farvestoffer de skal bruge baseret p\u00e5 deres forskning.<\/p>\n\n\n\n For eksempel, i denne artikel<\/a>fors\u00f8gte Mendon\u00e7a at evaluere virkningerne og de potentielle risici ved kationiske faste lipidnanopartikler (cSLN) i rotter. Mange nanopartikler udvikles og unders\u00f8ges hvert \u00e5r med det form\u00e5l at forbedre leveringen af l\u00e6gemidler eller gener til behandling af mange sygdomme. Et af de interessante sp\u00f8rgsm\u00e5l i denne unders\u00f8gelse var, om nanopartiklerne var i stand til at n\u00e5 hjernen ved at krydse blod-hjerne-barrieren. Denne barriere beskytter vores hjerne mod cirkulerende toksiner eller patogener, og normalt er det ikke \u00f8nskeligt, at molekyler krydser barrieren. Men i dette s\u00e6rlige tilf\u00e6lde, Mendon\u00e7a's<\/a> M\u00e5let var, at nanopartiklerne skulle krydse barrieren og n\u00e5 hjernen, s\u00e5 de kunne levere l\u00e6gemidler eller gener i en fremtidig anvendelse.<\/p>\n\n\n\n For at se, om nanopartiklerne var til stede i hjernens parenkym, brugte forfatterne en endotelcellemark\u00f8r for karrene kaldet RECA-1 (repr\u00e6senteret i r\u00f8dt), mens cellekernerne blev farvet med et farvestof kaldet DAPI (4\u2032,6-diamidino-2-phenylindol), som er bl\u00e5t. Vi kan ogs\u00e5 se sm\u00e5 gr\u00f8nne prikker for nanopartiklerne uden for karrene, hvilket betyder, at de n\u00e5ede ind i hjernens parenkym.<\/p>\n\n\n\n Se infografikken nedenfor med et repr\u00e6sentationsbillede.<\/p>\n\n\n Lad os forst\u00e5, hvad antistoffet mod RECA-1 (r\u00f8d) g\u00f8r.<\/p>\n\n\n\n Disse antistoffer er designet til at fungere som specifikke prober, og de er rettet mod et specifikt antigen (i vores tilf\u00e6lde proteinet RECA-1).<\/p>\n\n\n\n De kan m\u00e6rkes med en fluorofor eller genkendes senere af et sekund\u00e6rt antistof, der er forbundet med en fluorofor.<\/p>\n\n\n\n Derfor skal pr\u00f8ven aktiveres med en lyskilde, Det specifikke protein, du leder efter, vil blive genkendt i din pr\u00f8ve ved udsendelse af lys i en bestemt b\u00f8lgel\u00e6ngde.<\/a>.<\/p>\n\n\n\n I tilf\u00e6ldet med DAPI er dette farvestof modfarvning af kerner og nukleosomer, og det udsender bl\u00e5 fluorescens, n\u00e5r det bindes til AT-regioner i DNA'et.<\/p>\n\n\n\n Hvordan designer man et panel til immunofluorescens? <\/strong><\/p>\n\n\n\n Start med disse trin:<\/strong><\/p>\n\n\n\n Til sidst kan du se et eksempel p\u00e5 et hypotetisk eksperiment, hvor vi har Hoechst 33258 til nukleinsyrerne og et prim\u00e6rt antistof mod RECA-1 m\u00e6rket med et sekund\u00e6rt antistof Alexa Fluor 647.<\/p>\n\n\n\n Ideelt set ville vi bruge et mikroskop med en DAPI-kube (excitation 377\/50 og emission 447\/60) og en CY5-kube (excitation 628\/40 og emission 685\/40). Alle disse oplysninger har vi indsat p\u00e5 Visning af fluorescensspektre<\/a> og fik spektrene for begge farvestoffer og b\u00e5ndbredderne for begge kuber (se spektret i infografikken ovenfor).<\/p>\n\n\n\n Dette hypotetiske essay er et godt eksempel p\u00e5, at fluoroforernes spektre h\u00f8rer til inden for excitations- og emissionsfiltrene, hvilket g\u00f8r det muligt for forskeren at indfange sine pr\u00f8ver p\u00e5 den bedst mulige m\u00e5de.<\/p>\n\n\n\n Nu er det tid til at g\u00e5 i laboratoriet og oms\u00e6tte det hele til praksis!<\/p>\n\n\n\n Jeg h\u00e5ber, at disse tips kan hj\u00e6lpe dig med dit n\u00e6ste laboratoriefors\u00f8g. Held og lykke med det!<\/p>\n\n\n\n Referencer:<\/strong><\/p>\n\n\n\n En stor del af forskerens rutine er at designe og udf\u00f8re eksperimenter. Kombinationen af laboratorieteknikker vil besvare de fleste af de sp\u00f8rgsm\u00e5l, som forskere stiller, og arbejdsgangen med at foresl\u00e5 nye metoder afh\u00e6nger af forskerens baggrund og erfaring. For biologer kan cellebilleder sige meget om, hvad der foreg\u00e5r i [...].<\/p>","protected":false},"author":18,"featured_media":12982,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":[],"categories":[66,959,958,28,38],"tags":[51,554,962],"yoast_head":"\n![\"Mind](\"https:\/\/mindthegraph.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2021\/06\/preview-347880-7-788x1024.png\")
<\/a><\/figure><\/div>\n\n\n\n
\n